ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
43
зом величиной зерен геля и реже скоростью подвижной фазы). Не-
правильное, неоднородное заполнение колонки гелем также приво-
дит к увеличению ВЭТТ.
Методика измерений
Для выбранного типа геля (Сефадекс Г-75) и размеров колон-
ки (2,5х60см) оптимальная скорость элюции – около двух милли-
литров в минуту. В качестве элюента используется раствор хлори-
стого натрия 9 г/л. Фракции рекомендуется отбирать по 5 мл.
Из исходных растворов декстрана синего 2000 (18 мг/мл),
цитохромa С (30 мг/мл) и хромата калия (10 мг/мл) готовится
смесь отбором по 0,5 мл каждого компонента; смесь перемешивает-
ся и осторожно подслаивается под элюент над гелем шприцом на 2
мл с присоединенным к нему полиэтиленовым
капилляром. Очень
важно при этом не нарушить ровную поверхность геля.
После нанесения смеси колонка закрывается пробкой со
шлангом, идущим от колбы емкостью 250 мл, закрепленной на вы-
соте 20 см от верхнего конца колонки.
Оптическая плотность фракций определяется посредством
СФ-56 в кювете с оптической длиной пути 1 см, контрольным рас-
твором служит раствор элюента
. Выход с колонки декстрана синего
регистрируется при работе с фильтром № 8, а выход цитохрома С и
хромата калия – при работе с фильтром № 3.
При определении объема фракции в мерный цилиндр перено-
сится содержание 10–15 фракций, измеряется и рассчитывается
объем одной фракции, V
фр
. Высота столба геля в колонке, необхо-
димая при расчете ВЭТТ, измеряется линейкой.
Из графика оптической плотности определяются номера
фракций, соответствующих максимальному значению оптической
плотности для каждого из трех пиков.
Порядок выполнения работы
1. Ознакомиться с методикой измерений оптической плотно-
сти при помощи спектрофотометра СФ-56.
2. Подготовить экспериментальную смесь.
3. Заполнить ячейки
штатива пробирками.
44
4. Внести приготовленную смесь в колонку.
5. Время сбора элюата в пробирку ~4 минуты.
6. После выхода последней фракции измерить оптическую
плотность в каждой пробирке.
7. Построить профиль элюции, откладывая на оси абсцисс
номер фракции, а на оси ординат – оптическую плотность.
8. Рассчитать значение V
фр
.
9. Определить высоту геля в колонке.
10. Рассчитать V
e
для каждого вещества.
11. Заполнить табл. 1.
12. Вычислить величины K
av
для цитохрома С и хромата ка-
лия и занести в табл. 2.
13. Определить ВЭТТ для компонентов разделяемой смеси;
результаты записать в табл. 3.
Таблица 1
Тип геля Сефадекс Г-75
Элюент Раствор NaCl, 9 г/л
Скорость элюции
Время отбора одной фракции
Объем одной фракции
V
0
=V
e
декстрана синего
V
e
цитохрома С
V
e
хромата калия
V
t
объем геля в колонке
V
t
– V
0
Таблица 2
Компонент V
e
, мл V
e
– V
0
, мл
0
0
VV
VV
t
e
−
−
, мл
K
av
Декстран
Цитохром С
Хромат
зом величиной зерен геля и реже скоростью подвижной фазы). Не- 4. Внести приготовленную смесь в колонку.
правильное, неоднородное заполнение колонки гелем также приво- 5. Время сбора элюата в пробирку ~4 минуты.
дит к увеличению ВЭТТ. 6. После выхода последней фракции измерить оптическую
плотность в каждой пробирке.
Методика измерений 7. Построить профиль элюции, откладывая на оси абсцисс
номер фракции, а на оси ординат – оптическую плотность.
Для выбранного типа геля (Сефадекс Г-75) и размеров колон-
8. Рассчитать значение Vфр.
ки (2,5х60см) оптимальная скорость элюции – около двух милли-
9. Определить высоту геля в колонке.
литров в минуту. В качестве элюента используется раствор хлори-
10. Рассчитать Ve для каждого вещества.
стого натрия 9 г/л. Фракции рекомендуется отбирать по 5 мл.
11. Заполнить табл. 1.
Из исходных растворов декстрана синего 2000 (18 мг/мл),
12. Вычислить величины Kav для цитохрома С и хромата ка-
цитохромa С (30 мг/мл) и хромата калия (10 мг/мл) готовится
лия и занести в табл. 2.
смесь отбором по 0,5 мл каждого компонента; смесь перемешивает-
13. Определить ВЭТТ для компонентов разделяемой смеси;
ся и осторожно подслаивается под элюент над гелем шприцом на 2
результаты записать в табл. 3.
мл с присоединенным к нему полиэтиленовым капилляром. Очень
Таблица 1
важно при этом не нарушить ровную поверхность геля.
После нанесения смеси колонка закрывается пробкой со Тип геля Сефадекс Г-75
шлангом, идущим от колбы емкостью 250 мл, закрепленной на вы- Элюент Раствор NaCl, 9 г/л
соте 20 см от верхнего конца колонки. Скорость элюции
Оптическая плотность фракций определяется посредством Время отбора одной фракции
СФ-56 в кювете с оптической длиной пути 1 см, контрольным рас- Объем одной фракции
твором служит раствор элюента. Выход с колонки декстрана синего
V0=Ve декстрана синего
регистрируется при работе с фильтром № 8, а выход цитохрома С и
Ve цитохрома С
хромата калия – при работе с фильтром № 3.
При определении объема фракции в мерный цилиндр перено- Ve хромата калия
сится содержание 10–15 фракций, измеряется и рассчитывается Vt объем геля в колонке
объем одной фракции, Vфр. Высота столба геля в колонке, необхо- Vt – V0
димая при расчете ВЭТТ, измеряется линейкой.
Из графика оптической плотности определяются номера Таблица 2
фракций, соответствующих максимальному значению оптической
плотности для каждого из трех пиков. V e −V 0
Компонент Ve, мл Ve – V0, мл , мл Kav
V t −V 0
Порядок выполнения работы Декстран
1. Ознакомиться с методикой измерений оптической плотно- Цитохром С
сти при помощи спектрофотометра СФ-56. Хромат
2. Подготовить экспериментальную смесь.
3. Заполнить ячейки штатива пробирками.
43 44
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 20
- 21
- 22
- 23
- 24
- …
- следующая ›
- последняя »
