ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
73
Повышение уровня холестерина (гиперхолестеринемия) на-
блюдается при атеросклерозе, ишемической болезни сердца, ин-
фаркте миокарда, болезнях печени и почек, хроническом панкреа-
тите и злокачественных опухолях поджелудочной железы, сахар-
ном диабете, подагре, диете, богатой углеводами и жирами.
Снижение уровня холестерина (гипохолестеринемия) наблю-
дается при голодании, обширных ожогах, тяжелых острых заболе-
ваниях и инфекциях
, хронической сердечной недостаточности, при
приеме некоторых лекарственных препаратов.
Энзиматический метод определения холестерина
Находящийся в тканях холестерин входит в состав клеточных
мембран. Переходя в плазму крови, он этерифицируется, образуя
сложные эфиры с жирными кислотами. Реакция этерификации ка-
тализируется плазмоспецифическим ферментом – лецитинхолесте-
ролацилтрансферазой печени (ЛХАТ). При заболеваниях печени
нарушена выработка фермента, и
количество эфиров холестерина в
плазме крови уменьшается. В эритроцитах содержится лишь сво-
бодный холестерин, количество которого значительно отличается
от его содержания в плазме. Поэтому для практического исследо-
вания пригодны только плазма или сыворотка крови.
Энзиматический колориметрический метод определения об-
щего холестерина в плазме крови основан на использовании сопря-
женных ферментативных
реакций:
1) гидролиз эфиров холестерина до свободного холестерина,
катализируемый холестеролэстеразой:
Эфиры холестерина + H
2
O
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→⎯
эстеразахолестерол
холестерин + жирные кислоты;
2) превращение холестерина в холестенон с образованием пе-
рекиси водорода, катализируемое холестериноксидазой:
Холестерин + О
2
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→⎯
оксидазахолестерин
холестенон + Н
2
О
2
;
3) окисление перекисью водорода 4-аминоантипирина (4-
ААП) и фенола с образованием окрашенного продукта розово-
74
малинового цвета – хинонимина с максимумом поглощения при
500 нм:
2Н
2
О
2
+ 4-ААП + фенол
⎯⎯⎯⎯⎯→⎯
апероксидаз
химиноминовый краситель + 4 H
2
O.
Для определения концентрации холестерина измеряют спек-
тры поглощения анализируемого раствора и раствора с известной
концентрацией и вычисляют концентрацию холестерина по форму-
ле:
к
к
с
A
A
с
500
500
=
, (1)
где
500
A
– оптическая плотность анализируемого раствора;
500
к
A
– оп-
тическая плотность раствора с известной концентрацией холестери-
на;
к
с
– концентрация холестерина в калибровочном растворе.
Методика приготовления растворов
В настоящей работе используется плазма крови, полученная
центрифугированием цельной гепаринизированной венозной крови
в течение 15 мин. Для спектрофотометрического анализа необхо-
димо приготовить анализируемый, калибровочный растворы и рас-
твор сравнения.
Для приготовления анализируемого раствора в пробирку с
помощью дозирующих диспенсеров наливают 20 мкл плазмы
и 2,0
мл буферного раствора.
Для приготовления калибровочного раствора в пробирку на-
ливают 20 мкл раствора с известной концентрацией холестерина и
2,0 мл буферного раствора.
Раствор сравнения получается при смешивании в пробирке 20
мкл дистиллированной воды и 2,0 мл буферного раствора.
Приготовленные растворы тщательно перемешивают, избегая
пенообразования, и оставляют инкубировать в течение 15–20 мин.
при температуре 20–25
°С.
Оптическая плотность растворов измеряется при помощи
спектрофотометра Spectro 2000 RS в кюветах с длиной оптического
пути 1 см.
Повышение уровня холестерина (гиперхолестеринемия) на- малинового цвета – хинонимина с максимумом поглощения при
блюдается при атеросклерозе, ишемической болезни сердца, ин- 500 нм:
фаркте миокарда, болезнях печени и почек, хроническом панкреа- пероксидаз а
2Н2О2 + 4-ААП + фенол ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ химиноминовый краситель + 4 H2O.
тите и злокачественных опухолях поджелудочной железы, сахар-
ном диабете, подагре, диете, богатой углеводами и жирами. Для определения концентрации холестерина измеряют спек-
Снижение уровня холестерина (гипохолестеринемия) наблю- тры поглощения анализируемого раствора и раствора с известной
концентрацией и вычисляют концентрацию холестерина по форму-
дается при голодании, обширных ожогах, тяжелых острых заболе-
ле:
ваниях и инфекциях, хронической сердечной недостаточности, при
приеме некоторых лекарственных препаратов. A500 , (1)
с = 500 ск
Aк
Энзиматический метод определения холестерина
где A500 – оптическая плотность анализируемого раствора; Aк500 – оп-
Находящийся в тканях холестерин входит в состав клеточных
тическая плотность раствора с известной концентрацией холестери-
мембран. Переходя в плазму крови, он этерифицируется, образуя
на; ск – концентрация холестерина в калибровочном растворе.
сложные эфиры с жирными кислотами. Реакция этерификации ка-
тализируется плазмоспецифическим ферментом – лецитинхолесте-
ролацилтрансферазой печени (ЛХАТ). При заболеваниях печени Методика приготовления растворов
нарушена выработка фермента, и количество эфиров холестерина в В настоящей работе используется плазма крови, полученная
плазме крови уменьшается. В эритроцитах содержится лишь сво- центрифугированием цельной гепаринизированной венозной крови
бодный холестерин, количество которого значительно отличается в течение 15 мин. Для спектрофотометрического анализа необхо-
от его содержания в плазме. Поэтому для практического исследо- димо приготовить анализируемый, калибровочный растворы и рас-
вания пригодны только плазма или сыворотка крови. твор сравнения.
Энзиматический колориметрический метод определения об- Для приготовления анализируемого раствора в пробирку с
щего холестерина в плазме крови основан на использовании сопря- помощью дозирующих диспенсеров наливают 20 мкл плазмы и 2,0
женных ферментативных реакций: мл буферного раствора.
1) гидролиз эфиров холестерина до свободного холестерина, Для приготовления калибровочного раствора в пробирку на-
катализируемый холестеролэстеразой: ливают 20 мкл раствора с известной концентрацией холестерина и
холестеролэстераза 2,0 мл буферного раствора.
Эфиры холестерина + H2O ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ холестерин + жирные кислоты; Раствор сравнения получается при смешивании в пробирке 20
2) превращение холестерина в холестенон с образованием пе- мкл дистиллированной воды и 2,0 мл буферного раствора.
рекиси водорода, катализируемое холестериноксидазой: Приготовленные растворы тщательно перемешивают, избегая
холестерин оксидаза пенообразования, и оставляют инкубировать в течение 15–20 мин.
Холестерин + О2 ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ холестенон + Н2О2;
при температуре 20–25°С.
3) окисление перекисью водорода 4-аминоантипирина (4- Оптическая плотность растворов измеряется при помощи
ААП) и фенола с образованием окрашенного продукта розово- спектрофотометра Spectro 2000 RS в кюветах с длиной оптического
пути 1 см.
73 74
