Система аскорбиновой кислоты растений. Чупахина Г.Н. - 80 стр.

процессов, не связанных с фотосинтезом, а также для изучения биогенеза хлоро-
пласта, его функциональной активности. В настоящее время имеется целый ряд
примеров успешного использования подобных объектов для исследования неко-
торых физиологических проблем, и в частности для выяснения механизмов фо-
тосинтеза, его структурной и функциональной организации [411].
    Под действием СМ ингибируется синтез хлорофилла, развитие структуры
хлоропластов [222, 228]. Детального исследования влияния СМ на биосинтез
белков хлоропласта не проводилось. В связи с этим нами выполнена работа по
изучению действия СМ на состав и активность некоторых белков электрон-
транспортной цепи, ферментов цикла Кальвина, ассимиляцию СО2 и продукты
пятиминутного фотосинтеза [182].
    В опытах использовались вырезки из зеленых и альбиносных участков му-
тантных листьев ячменя. Контролем служили зеленые проростки. Наличие или
отсутствие белков электрон-транспортной цепи контролировали электрофорезом
в ПААГ. Для выделения фракции белков навеску листьев 1,5 г измельчали в
жидком азоте, затем экстрагировали 0,05 М трис-НСl+ 0,1% тритон Х-100. Белки
осаждали холодным ацетоном (1:1 объем/объем), осадок экстрагировали выше-
указанным буфером. Нерастворимые белки отделяли центрифугированием при
10 тыс. g в течение 15 минут. Супернатант хроматографировали на сефадексе Г-
25, белковую фракцию, выходящую из колонки первой, использовали для элек-
трофореза.
    Изоферменты пероксидазы в ПААГ выявляли по Орнстейну [356], ферре-
доксин-НАДФ-редуктазу, ферредоксин и пластоцианин по Христину и др. [164,
165]. Перед электрофорезом белковые метчики и экстракты листьев инкубиро-
вали 40 минут при 90° С в присутствии додецилсульфата натрия (2%) и дитиот-
реитола (0,01%).
    Для получения фракции водорастворимых белков листья растирали в трис-
НСl буфере 0,05 М, рН 7,8, содержащим дитиотреитол 0,001 М, MgCl2 0,01 М,
ЭДТА 0,0005 M. После разрушения гомогенат центрифугировали (20 тыс.
об/мин) при 0° С в течение 30 минут. Скорость ферментативной реакции изме-
ряли в свежеприготовленных экстрактах. Активность РДФ-карбоксилазы опре-
деляли радиометрическим методом, рибозо-5-фосфатизомеразы и фосфорибуло-
киназы - колориметрическим [129].
    Продукты пятиминутного фотосинтеза выявляли в листьях, предварительно
экспонированных в газовой камере с 14СO2 (конц. 0,033%), фиксацию проводили
кипящим 96%-ным этанолом. Далее листья растирали и экстрагировали нисхо-
дящими концентрациями этанола, сумму спиртоводорастворимых соединений
лиофильно высушивали, растворяли в 1 мл дистиллята, определенную аликвоту
наносили на бумажную хроматограмму. Для разделения соединений применяли
систему растворителей: 1 направление - этанол, насыщенный аммиаком, 2 на-
правление - бутанол - метанол - этанол - муравьинная кислота - вода
(30:30:36:5:4 соответственно). Хроматограммы совмещали с рентгеновской


78