Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений. Учебно-методическое пособие. Часть 2. Цыренов В.Ж. - 9 стр.

                                                                           1             2            3               4
                                                                      Семена сухие     15-20        10-15           12-15
     2.1.Стерилизация.
                                                                    Семена набухшие     6-10         6-8             6-8
     Изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые         Ткани стебля     20-40        20-25             -
помещают на питательную среду, легко поражаются микроорга-               листья          1-3        0,5-3            3-5
низмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и пита-           апексы          1-10        0,5-7            2-7
тельную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (вве-
дение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) прово-           После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем рас-
дят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными ин-        творе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скаль-
струментами. Стерильность надо соблюдать и во время культиви-       пелем удаляют наружные слои клеток на срезах эксплантов, так
рования изолированных тканей.                                       как он может быть поврежден при стерилизации.
     Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в              Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной
фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в         ткани. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у
сушильном шкафу при температуре 160оС в течение 1,5 – 2 ч. Пи-      тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверх-
тательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120оС       ностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики,
и давлении 0.75 – 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питатель-   которые и убивают микробы внутри ткани. Следует, однако, заме-
ных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании,       тить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации
их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный       внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно дейст-
фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добав-         вующий антибиотик.
ляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температу-
ры 40оС.                                                                 2.2.Питательные среды.
     Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным             Изолированные клетки и ткани культивируют на многоком-
источником заражения, так как на их поверхности всегда находит-     понентных питательных средах. Они могут существенно разли-
ся эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная           чаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно
стерилизация, которую проводят следующим образом. Предвари-         входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углево-
тельно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, про-     ды, витамины. Фитогормоны и их синтетические аналоги. Углево-
мывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем рас-        ды (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой пита-
тительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих          тельной смеси в концентрации 2-3%. Они необходимы в качестве
веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации      питательного компонента, так как большинство каллусных тканей
представлены в табл. 1.                                             лишено хлорофилла и не способны к автотрофному питанию. По-
                                                       Таблица 1    этому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в
           Стерилизация исходного растительного материала           темноте.
                       (по Р.Г.Бутенко, 1999)
                                                                         Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фос-
                            Время стерилизации, мин
    Объект                                    перекись водорода     фата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды зна-
                  диацид        сулема 0,1%                         чительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Од-
                                                    10-12%

                                                              19          20