ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
95
Традиционно из биолюминесцентных систем в экологиче-
ском мониторинге использовался долгое время только инте-
гральный тест на светящихся бактериях. Вместе с тем в
литературе имелось достаточно большое количество данных,
убедительно демонстрирующих высокую чувствительность
люциферазных реакций к действию токсических веществ. При
этом сравнение их влияния на биолюминесценцию in vivo и in
vitro показывало существование зависимости
между степенью
токсичности в анализируемом образце и изменением парамет-
ров свечения обеих биолюминесцентных систем, но чувстви-
тельность систем in vitro была часто выше в 100-1000 раз.
Таким образом, имелись все предпосылки для использования в
интегральных биотестах токсичности среды не только
светящихся бактерий, но и выделенных из них люцифераз. Бо-
лее того, переход от систем
in vivo к системам in vitro при из-
мерении параметра жизнедеятельности бактерий –
светоизлучения - позволил создать реагент, увеличивающий
точность биотеста. Это послужило основой для выдвижения
концепции нового направления биотестирова-ния и биолюми-
несцентного анализа - люциферазных биотестов токсичности.
Рис.24. Принципы ферментативного биотестирования
Ксенобиотик
Токсикант
Люцифераза
Биолюминометр
Высокая чувствительность
96
Принцип люциферазных биотестов - обнаружение токси-
ческих свойств тестируемых веществ и смесей по их влиянию
на биолюминесцентные ферментативные реакции. В основе
биолюминесцентных биотестов чаще всего лежит ингибирова-
ние люциферазы компонентами анализируемых смесей
(см.рис.24). Новое направление биолюминесцентного биотес-
тирования отличается тем, что в качестве тест-объектов вместо
светящихся бактерий используются
реакции, катализируемые
люциферазой, биферментной системой: NADH:FMN-
оксидоредуктаза - люцифераза. В настоящее время на примере
алкогольдегидрогеназы и трипсина обсуждается возможность
использования трехферментных биолюминесцентных сис-тем
для экологического мониторинга. Основными тест-функциями
являются параметры названных биолюминесцентных реакций.
Основными условиями для применения люциферазного
биотеста считаются наличие прибора-биолюминометра и реак-
тивов (препаратов ферментов и субстратов)
для проведения
измерений, базовые биолюминесцентные методы, а также чув-
ствительность биолюминесцентных реакций к компонентам
анализируемой среды и установление соответствия между ток-
сичностью среды и степенью изменения параметров биолюми-
несцентных реакций.
Базовый метод, основанный на люциферазной реакции, ме-
тодически прост: в измерительной кювете смешивают люцифе-
разу и ее субстраты и регистрируют на
биолюминометре
контрольную вспышку свечения. Далее процедура повторяется
в присутствии анализируемой пробы. Токсичность смеси опре-
деляют по изменению величины интенсивности биолюминес-
ценции в присутствии пробы по сравнению с контролем.
Базовые методы с использованием биферментной системы
осуществляются смешиванием люциферазы, NADH:FMN-
оксидоредуктазы и их субстратов. Модификации этих методов
отличаются моментом ввода анализируемых веществ: до
ини-
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 46
- 47
- 48
- 49
- 50
- …
- следующая ›
- последняя »
