Физико-химические основы биолюминесцентного анализа - 47 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

93
Сделано несколько биотестов с использованием мутантов
по свечению у фотобактерий. Например, тест на мутагенность
основан на способности мутагенов увеличивать скорость об-
ратных мутаций у темновых штаммов светящихся бактерий.
Чувствительность метода (нанограммы) в 100 раз превышает
чувствительность общепринятых методов анализа мутагенов.
Однако сопоставление скоростей реверсий, происходящих
спонтанно и под влиянием анализируемых мутагенов
, а также
то, что за время анализа (2 ч) невозможно обнаружение ревер-
тировавших бактерий в силу их небольшого числа, ставит под
сомнение генетическую основу этого эффекта и достоверность
самого теста.
Скрининг мутагенов проводят также инкубируя индика-
торные темновые штаммы P.leiognathi в течение 30 мин в ис-
пытуемом растворе, затем отмытые от мутагена клетки
засевают в свежую среду. Свечение обработанных клеток из-
меряют с интервалами 4 - 6 ч. В зависимости от мутагена, его
токсичности и концентрации через 10 - 40 ч культивирования
наблюдается увеличение свечения по сравнению с контролем,
связанное с накоплением в пробирках ярко светящихся ревер-
тантов. Чувствительность метода для нитрозогуанидина -1
мкг/мл, нитрозометилмочевины - 0,25 мг/мл, этилметилсульфа-
та - 0,1 мкг
/мл, фурагина - 0,25 мкг/мл.
Считается, что среди большого разнообразия мутантов
можно выбрать штаммы, избирательно чувствительные к опре-
деленным веществам. Однако успешных работ в этом направ-
лении пока мало. Зато появились работы, сделанные с
использованием рекомбинантных светящихся бактерий, где ус-
пешно эксплуатируется идея о том, что излучающие ферменты
– люциферазы и их
гены в последние годы стали самыми при-
влекательными и употребительными маркерами в генетике, эм-
бриологии, молекулярной биологии, в мониторинге
окружающей среды и для биохимической диагностики в меди-
цине. Поэтому помимо использования в люминесцентном ана-
лизе природных светящихся бактерий ведется разработка
94
новых направлений биотестирования, и одним из них является
использование
в качестве тест-объекта люминесцентных ре-
комбинантных штаммов различных бактерий (E.coli,
Pseudomonas, Rysobium и др.) К настоящему времени описано
клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы
светящихся бактерий Vibrio harveyi, V.fischeri и Photobacterium
leiognati в плазмидном векторе клеток различных микроорга-
низмов [20]. Введение lux-гена позволяет создавать высокочув-
ствительные биосенсоры, обладающие высокой
специфичностью. Например, сконструированы бактерии, в ко-
торых под действием
токсикантов увеличивается свечение. С
помощью такого биолюминесцентного биосенсора, созданного
на основе E.coli, можно установить наличие в среде (и в смесях
тяжелых металлов) ртути. Принцип действия этого биосенсора
заключается в увеличении экспрессии lux-генов при наличии в
среде ионов ртути. Чувствительность метода выше, чем в атом-
ной абсорбционной спектроскопии. Подобный биосенсор на
основе
бактерий Pseudomonas putida сконструирован и для оп-
ределения в среде нафталина, толуола, ксилола. Бактерии рода
Rysobium использованы для конструирования люминесцентно-
го биосенсора загрязнения почвы. Некоторые штаммы бакте-
рий рода Salmonella использованы для конструирования
люминесцентного биотеста, позволяющего определять распре-
деление бактерий на поверхности различных пищевых продук-
тов. Было предложено встраивать lux-гены в бактериофаги,
которые, внедряясь
в клетку-хозяина, через 30-50 мин вызыва-
ют экспрессию lux-генов. С использованием этого приема был
разработан метод определения бактериальных клеток непо-
средственно в молоке, который позволяет “уловить” до 10 кле-
ток в образце.
3.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ
СИСТЕМЫ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ

Страницы