Физико-химические основы биолюминесцентного анализа - 45 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

89
рий сильно варьирует в зависимости от штамма, условий куль-
тивирования бактерий, количества бактерий, взятых для анали-
за.
Трудности возникают не только при получении культуры с
длительным (сутки и более) постоянным свечением, но и в
поддержании постоянства характеристик бактерий в музейной
культуре. По-видимому, в основе таких затруднений лежит не-
достаточное
знание нами физиологии светящихся организмов,
назначения биолю-минесценции и роли ее в природных экоси-
стемах и для самих бактерий. В связи с этим меры по поддер-
жанию постоянных характеристик бактерий носят случайный
характер, и нередко штаммы светящихся бактерий теряют спо-
собность светиться в коллекциях спустя 3-4 года после выделе-
ния их
из природной экосистемы и ряда пассажей.
Проблема стандартизации культуры бактерий решается в
настоящее время двумя путями: использованием непрерывной
культуры светящихся бактерий и получением реагента на ос-
нове лиофильно высушенных бактерий.
При непрерывном культивировании в люминостате воз-
можно поддержание культуры бактерий в определенном фи-
зиологическом состоянии с постоянной в течение некоторого
времени
интенсивностью свечения посредством управления
протоком питательной среды. Добавление в культиватор среды
происходит, когда люминесценция бактерий превышает опре-
деленный, заранее выбранный уровень возможного свечения
бактерий. Подача питательной среды прекращается при
уменьшении свечения бактерий до заданной интенсивности,
люминесценция бактерий при этом продолжает падать за счет
снижения удельного свечения, но уравновешивается за счет
увеличения числа клеток бактерий и, соответственно, возраста-
ния интенсивности свечения. Однако постоянный уровень лю-
минесценции P.leiognathi и P.phosphoreum удается поддер-
живать в люминостате только около суток. Для аналитических
измерений отбирают из люминостата 2 мл суспензии светя-
щихся бактерий, и далее процедура определения количества
90
токсиканта не отличается от представленной выше. Чувстви-
тельность анализа в
этих условиях для фенола - 50 мкМ, для
2,4-динитрофенола - 0,1 мкМ. Использование люминостата су-
щественно повышает точность измерений, но чувствительность
анализа ниже почти в 10 раз по сравнению с периодической
культурой. Кроме того, к недостаткам непрерывного культиви-
рования следует также отнести техническую сложность и
большой расход питательной среды.
Значительными преимуществами обладают лиофилизован-
ные светящиеся
бактерии, которые используются при анализе
некоторых антибиотиков, ингибирующих свечение или мико-
токсинов. Лиофильно высушенные бактерии в устройстве
"Микротокс" применяют для тестирования микроколичеств
ароматических углеводов, дыха-тельных ядов и других ве-
ществ, загрязняющих воду. Чувствительность бактерий к мико-
токсинам сохраняется в течение 5 ч и для некоторых токсинов
выше, чем в свежей
суспензии клеток. Эти тесты на токсич-
ность отличаются чувствительностью и точностью (ошибка ±
10 %), простотой использования, дешевизной, экспрессностью
(30 мин) и другими несомненными преимуществами по срав-
нению с известными биотестами на водорослях, рыбах, дафни-
ях и т.п.
Препараты лиофилизованных бактерий выпускают в Ин-
ституте биофизики СО РАН и некоторых зарубежных
фирмах.
Beckman Instruments продает лиофильно высушенные светя-
щиеся бактерии в комплекте с биолюминометром. Восстанов-
ленные в растворе NaCl бактерии имеют постоянный уровень
свечения в течение 5 ч.
При использовании теста на светящихся бактериях для
увеличения воспроизводимости результатов необходимо кон-
тролировать состояние используемых в биотесте бактерий, ус-
ловий их выращивания и применения. Так, на фотобактерии
могут влиять параметры анализируемой среды - температура,
рH, жесткость воды и растворенный кислород. Контроль толь-
ко одного параметра - свечения - в этих биотестах может при-

Страницы