Физико-химические основы биолюминесцентного анализа - 67 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

133
Перед началом работы проверяют готовность установки,
готовят нужные концентрации растворов тетрадеканаля, люци-
феразы.
Приготовить раствор 10
-4
М раствор бензохинона в воде и
0.5 10
-3
М раствор антрахинона в этаноле. При необходимости
раствор антрахинона подогреть. Затем развести раствор антра-
хинона в 10 раз водой, получив водно-спиртовый раствор ан-
трахинона.
Состав реакционной смеси:
1. 50 мкл 0.0025%-ного водного раствора альдегида;
2. 5 мкл препарата люциферазы;
3. 200 мкл 0.25 M фосфатного буфера, рН 7.0;
4. 0-50 мкл раствора бензохинона или антрахинона (0 мкл -
контрольное измерение);
5. 300 мкл FMN
Н
2
.
В начале и в конце исследования провести контрольные
замеры биолюминесцентного сигнала без хинонов (5-6 сход-
ных результатов). Добавлять различные объемы раствора бен-
зохинона (2-50мкл) в биолюминесцентную систему перед
FMNН
2
(6-8 объемов по 5-6 замеров) и регистрировать интен-
сивность сигнала (I). Для контрольных замеров и замеров с ка-
ждым объемом посчитать среднее и среднеквадратичное
отклонение. Представить зависимость интенсивности биолю-
минесценции от концентрации бензохинона в координатах I/I
0
= f(C,M) и ln(I/I
0
) = f(C,M)
По начальному прямолинейному участку полученной кри-
вой посчитать константу ингибирования бензохинона К по
формуле
ln(I/I
0
) = -KC.
Повторить эксперимент и расчеты, используя вместо рас-
твора бензохинона раствор антрахинона. Сравнить полученные
величины К. Объяснить различия.
134
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА N6 (6 ЧАСОВ).
ДЕЙСТВИЕ ХИНОНОВ НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНУЮ
БИФЕРМЕНТНУЮ СИСТЕМУ
Биферментная система отличается от моноферментной
присутствием фермента NADH:FMN-оксидореду-ктазы (R), ка-
тализирующего реакцию восстановления FMN до FMNH
2
:
NADH:FMN-оксидоредуктаза
FMN+ NADН + H
+
→ FMNH
2
+ NAD
+
.
Для биферментной системы характерно длительное (ста-
ционарное) свечение. В этой системе будут присутствовать все
эффекты, характерные для моноферментной люциферазной
системы, рассмотренные в предыдущей работе. Эти эффекты
будут уменьшать интенсивность биолюминесцентного сигнала
в присутствии хинона по сравнению с контролем без хинона.
Одновременно будут присутствовать эффекты, связанные с
воздействием хинонов на реакцию
, катализируемую
NADH:FMN-оксидоредуктазой.
Хиноны в присутствии NADH способны восстанавливаться
(так же, как и FMN) с образованием гидрохинонов:
хинон + NADН + H
+
→ гидрохинон + NAD
+
.
В этой реакции NADH отдает 2 электрона (и протон), явля-
ясь восстановителем, а хинон принимает 2 электрона (и 2 про-
тона), являясь окислителем.
Реакция (2) конкурирует с реакций (1), если окислительно-
восстановительный потенциал этой реакции больше, чем реак-
ции (1). В этом случае величина стандартного окислительно-
восстановительного потенциала полуреакции (Е
0
1/2
) соответст-
вующего хинона должна быть больше, чем Е
0
1/2
FMN.
В табл. 8 приведены Е
0
1/2
некоторых хинонов и FMN.

Страницы