ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
2.2 Комбинированные АСМ и оптические исследования биологических образцов
Методы оптической микроскопии, такие как методы светлого поля, метод фазового
контраста, флуоресцентная микроскопия и др. широко используются в различных областях
биологических исследований. Большинство биологических лабораторий использует эти
методы в обычной практике. Однако разрешение всех этих методов ограничено длиной волны
излучения. Характерный диаметр клеток составляет 10÷20 мкм, бактерий от 0.5 до 3÷5 мкм,
эти величины в 5 раз мельче мельчайшей частицы, видимой невооруженным глазом. Поэтому
первое изучение клеток стало возможным только после появления оптических микроскопов. В
конце XVII в. Антонио ван Левенгук изготовил первый оптический микроскоп, до этого люди
и не подозревали о существовании болезнетворных микробов и бактерий.
Трудности изучения клеток связаны с тем, что они бесцветны и прозрачны, поэтому
открытие их основных структур состоялось только после введения в практику красителей.
Красители обеспечили достаточный контраст изображения. С помощью оптического
микроскопа можно различать объекты, отстоящие друг от друга на 0.2 мкм, т.е. самыми
маленькими объектами, которые еще можно различать в оптическом микроскопе являются
бактерии и митохондрии. Изображения более мелких элементов клеток искажаются
эффектами, вызванными волновой природой света.
Для приготовления долго сохраняющихся препаратов клетки обрабатывают фиксирующим
агентом с тем, чтобы иммобилизовать и сохранить их. Кроме того, фиксация повышает
доступность клеток красителям, т.к. макромолекулы клеток скрепляются поперечными
сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Чаще всего в
качестве фиксаторов выступают альдегиды и спирты (например, глутаральдегид или
формальдегид формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и
сшивают соседние молекулы). После фиксации ткани обычно нарезают микротомом на очень
тонкие срезы (толщиной от 1 до 10 мкм), которые затем помещают на предметное стекло. При
таком способе подготовки можно повредить структуру клеток или макромолекул, поэтому
предпочтительным методом является быстрое замораживание.
Замороженную ткань режут микротомом, установленным в холодной камере. После
приготовления срезов клетки окрашивают. В основном для этой цели используют
органические красители (малахитовую зелень, судан черный и т.д.). Каждый из них
характеризуется определенным сродством к клеточным компонентам, например, гематоксилин
обладает сродством к отрицательно заряженным молекулам, поэтому позволяет выявить в
клетках ДНК. Если та или иная молекула представлена в клетке в незначительном количестве,
то удобнее всего использовать флуоресцентную микроскопию.
31
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 29
- 30
- 31
- 32
- 33
- …
- следующая ›
- последняя »
