Переход спираль-клубок в молекуле ДНК. - 8 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

МФТИ | Москва

Рубрика: 

при увеличении ионной силы раствора. На опыте была получена следующая
эмпирическая зависимость от концентрации :
m
T
+
Na
)lg736)(6.2(176
+
−−−= NaXT
AT
(13)
Возможность протонирования амино- и имино- групп, участвующих в
образовании водородных связей между комплементарными основаниями ДНК,
объясняет стабильности ДНК от рН раствора. Эта зависимость колоколообраз-
ная, и ДНК наиболее стабильна при
7
≤
pH . Для разбавления ДНК используется
цитратный буферный раствор. Сокращенно обозначаемый SSC. Раствор 0,1
SSC содержит 0,15М NaCl b 0.015 M трехзамещенного лимонного натрия.
Концентрация катионов Na в таком растворе составляет 0,195М.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В настоящей работе тепловая денатурация – «плавление» ДНК изучается
с помощью спектрофотометра Перкин-Элмер-552.
3.1 Приготовление растворов ДНК.
Плавление ДНК производится в растворах цитратного буфера при
7
<
pH ,
приготовленных из исходного раствора 10 SSC разбавлением в
дистиллированной воде до 0,1 SSC.
3.2 Исследование изменения спектра поглощения раствора ДНК на
спектрофотометре Перкин-Элмер-552 при плавлении ДНК.
1. Ознакомиться с описанием спектрофотометра и изучить порядок работы на
нем. Так как прибор проводит автоматическую калибровку нулевого
поглощения, включение ламп производить сразу же после включения
клавиши «POWER».
2. Налить в кювету 3мл буфера (0,1 SSC) и поставить в канал сравнения.
3. В другую кювету налить 3мл буфера, добавить 2-3 капли раствора ДНК в
буфере, перемешать раствор стеклянной палочкой и поставить в
измерительный канал спектрофотометра.
4. Измерить поглощение раствора ДНК на длине волны 260 нм. При
необходимости добавить исходный раствор ДНК так, чтобы на этой длине
волны оказалась А=0,15.
5. Снять спектр поглощения раствора ДНК в диапазоне 210-300нм.
6. Установить на контактном термометре температуру . Проверить
уровень воды в термостате. При необходимости добавить дистиллированной
воды в термостат. Включить термостат. Нагреть воду в термостате до .
C
o
45
C
o
45
7. Дать пятиминутную выдержку, открыть кювету, стеклянной палочкой
убрать со стенки пузырьки воздуха, кювету закрыть и дать пятиминутную
выдержку. Контролировать поглощение на длине волны 260 нм.
8
при увеличении ионной силы раствора. На опыте была получена следующая
эмпирическая зависимость Tm от концентрации Na + :
                       T = 176 − (2.6 − X AT )(36 − 7 lg Na + )           (13)

      Возможность протонирования амино- и имино- групп, участвующих в
образовании водородных связей между комплементарными основаниями ДНК,
объясняет стабильности ДНК от рН раствора. Эта зависимость колоколообраз-
ная, и ДНК наиболее стабильна при pH ≤ 7 . Для разбавления ДНК используется
цитратный буферный раствор. Сокращенно обозначаемый SSC. Раствор 0,1
SSC содержит 0,15М NaCl b 0.015 M трехзамещенного лимонного натрия.
Концентрация катионов Na в таком растворе составляет 0,195М.

                   3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

     В настоящей работе тепловая денатурация – «плавление» ДНК изучается
с помощью спектрофотометра Перкин-Элмер-552.

3.1 Приготовление растворов ДНК.

     Плавление ДНК производится в растворах цитратного буфера при pH < 7 ,
приготовленных из исходного раствора 10 SSC разбавлением в
дистиллированной воде до 0,1 SSC.

3.2 Исследование изменения спектра поглощения раствора ДНК на
   спектрофотометре Перкин-Элмер-552 при плавлении ДНК.

1. Ознакомиться с описанием спектрофотометра и изучить порядок работы на
   нем. Так как прибор проводит автоматическую калибровку нулевого
   поглощения, включение ламп производить сразу же после включения
   клавиши «POWER».
2. Налить в кювету 3мл буфера (0,1 SSC) и поставить в канал сравнения.
3. В другую кювету налить 3мл буфера, добавить 2-3 капли раствора ДНК в
   буфере, перемешать раствор стеклянной палочкой и поставить в
   измерительный канал спектрофотометра.
4. Измерить поглощение раствора ДНК на длине волны 260 нм. При
   необходимости добавить исходный раствор ДНК так, чтобы на этой длине
   волны оказалась А=0,15.
5. Снять спектр поглощения раствора ДНК в диапазоне 210-300нм.
6. Установить на контактном термометре температуру 45 o C . Проверить
   уровень воды в термостате. При необходимости добавить дистиллированной
   воды в термостат. Включить термостат. Нагреть воду в термостате до 45 o C .
7. Дать пятиминутную выдержку, открыть кювету, стеклянной палочкой
   убрать со стенки пузырьки воздуха, кювету закрыть и дать пятиминутную
   выдержку. Контролировать поглощение на длине волны 260 нм.

                                       8

Страницы