Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 4
химически модифицированные флуорохромы нового поколения, как правило,
обладают высокой квантовой эффективностью.
В процессе освещения происходит постепенное уменьшение
интенсивности флуоресценции. Это явление носит название «выцветание»
флуорохрома. Степень выцветания зависит от интенсивности возбуждающего
света и времени экспозиции. На скорость и степень выцветания могут оказывать
влияние физические и химические изменения самого флуорохрома, наличие в
растворе других флуорохромов, а также окислителей или солей тяжелых
металлов. Современные флуорохромы выцветают значительно медленнее, чем
те, которые использовались 10-15 лет назад. Тем не менее, проблема замедления
снижения уровня флуоресценции все еще актуальна, поскольку она напрямую
связана с возможностью получения качественного изображения исследуемого
объекта.
Для защиты флуорохромов от выцветания готовые препараты
необходимо хранить в темноте при низких температурах (4
о
С для водных
заключающих сред и кратковременного хранения, -20
о
С для длительного
хранения препаратов в средах на основе незастывающих компонентов). Водные
заключающие среды обычно представляют собой буферные растворы,
использованные при окраске и отмывке препаратов. В качестве незастывающих
заключающих сред для флуоресцентной микроскопии могут быть использованы
нефлуоресцирующее иммерсионное масло, жидкий парафин, глицерин разной
концентрации, а также синтетические заключающие среды на основе полимеров
(изобутилметакрилат, полистирол).
Использование в заключающих средах фотозащитных добавок, таких как
DABCO, N-пропилгаллат, пара-фенилендиамин, продлевает время
флуоресценции в 15-30 раз – и это существенно для фиксации изображения. В
настоящее время многие фирмы, производящие различные реактивы,
коньюгированные с флуорохромами, а также флуоресцентные красители,
предлагают готовые заключающие среды с фотозащитными добавками.
Приготовить такие среды можно самостоятельно по прописям (Протоколы
1.1.1-1.1.4), затем расфасовать их в пробирки по 1 мл и хранить при –20
о
С.
Протокол 1.1.1. Фотозащитная среда 1
1. К 1мл 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5) или 1х PBS добавить 233мг DABCO.
2. Перемешать пипетированием.
3. Добавить 9 мл нефлуоресцирующего глицерина.
4. Оставить на ночь в термостате при 65
о
С.
5. Профильтровать теплый раствор через фильтр с размером пор 45 мкм.
6. Расфасовать и хранить при –20
о
С до использования.
Протокол 1.1.2. Фотозащитная среда 2
1-1,2% DABCO
2х SSC
50% нефлуоресцирующего глицерина
Коэффициент преломления такой среды позволяет совмещать флуоресцентную
и фазово-контрастную микроскопию, так как в ней снижено содержание
глицерина.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 5
- 6
- 7
- 8
- 9
- …
- следующая ›
- последняя »
