ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
5
ферментативной реакции. Выявление групп активного центра при изучении влияния рН на
скорость ферментативной реакции. Двухсубстратные ферментативные реакции. Различные
механизмы присоединения субстратов к ферменту: неупорядоченное связывание,
упорядоченное связывание, механизм «пинг-понга». Кинетика двухсубстратных реакций,
обработка экспериментальных данных.
Общие правила работы с ферментами. Способы количественного выражения активности.
Единицы ферментов. Удельная активность, молекулярная активность, активность
каталитического центра. Способы регистрации ферментативной активности – по конечной
точке, непрерывный. Методы определения активности ферментов: колориметрический,
спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный,
иммунохимический и др. Методы выделения и очистки ферментов. Фракционное
высаливание, фракционирование органическими растворителями, избирательное осаждение.
Адсорбция на гелях. Хроматография (ионообменная, тонкослойная, аффинная). Гель-
фильтрация. Электрофорез, изоэлектрофокусирование. Критерии чистоты ферментных
препаратов (ультрацентрифугирование, электрофорез, растворимость, кристаллизация).
Химическая структура ферментов. Ферменты – простые и сложные белки. Уровни
структурной организации ферментов – первичный, вторичный, супервторичный
(надвторичный), доменный, третичный, четвертичный. Методы изучения различных уровней
организации ферментов – оптические, РСА, кинетические, генно-инженерные,
компьютерное моделирование. Принципы пространственной организации молекул
ферментов, проблема сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию.
Структура и роль шаперонов. Роль доменов в пространственной организации молекул
ферментов. Классификация доменов, их функциональные характеристики
(коферментсвязывающие, регуляторные, обеспечивающие связь с мембранами). Активный
центр ферментов. Якорный (субстратсвязывающий) и каталитический сайты активных
центров. Активные центры простых и сложных ферментов. Методы определения
аминокислот, входящих в активные центры ферментов. Химическая модификация, действие
ингибиторов, квазисубстраты, алкилирование, блокирование SH-групп. Роль серина,
гистидина, лизина, тирозина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот в
активных центрах. Структура активных центров на примере ЛДГ, СОД, карбоксипептидазы
А. Использование методов РСА для изучения топографии активных центров.
Кофакторы. Классификация, биохимические функции. Коферменты окислительно-
восстановительных реакций – NAD, NADP, FMN, FAD, железопорфирины, убихиноны,
аскорбиновая кислота. Коферменты – переносчики групп: нуклеозидфосфаты, фосфаты
сахаров, HSCoA, пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота. Коферменты синтеза,
6
изомеризации и расщепления связей: тиаминдифосфат, биотин, кобамидные коферменты.
Роль металлов в функционировании ферментов. Истинные металлоэнзимы (СОД,
карбоксипептидаза А, цитохромоксидаза и др.). Металлоэнзимные комплексы (NAD-
зависимая изоцитратдегидрогеназа).
Ферментативный катализ. Сущность явления катализа. Гомогенный и гетерогенный
катализ. Взаимодействие метаболитов с активными центрами. Ферментсубстратный
комплекс, стадии образования и распада, доказательства существования. Природа сил,
стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
(водородные связи, гидрофобные взаимодействия, координационные связи,
электростатические взаимодействия, силы Ван-Дер-Ваальса). Факторы, определяющие
эффективность и специфичность ферментативного катализа: эффект сближения, ориентации,
напряжения, индуцированного соответствия, кислотно-основного и ковалентного катализа.
Использование энергии связывания фермента с субстратом в катализе. Работы Э.Фишера,
Дж. Кошланда, В. Дженкса. Методы изучения механизмов ферментативных реакций:
изотопный обмен, спектрофотометрический, кинетический методы, использование
специфических ингибиторов. Химические модели. Механизм действия протеолитических
ферментов на примере лизоцима и карбоксипептидазы А. Механизм действия
аминотрансфераз. Каталитические антитела (абзимы), как примитивные ферменты.
Аллостерические ферменты. Понятие аллостерических центров. Десенсибилизация как
способ доказательства разобщенности аллостерических и активных центров. Понятие
кооперативности. Типы кооперативных взаимодействия: гомотропные, гетеротропные,
положительные, отрицательные. Кинетика аллостерических ферментов. Коэффициент Хилла
– мера отклонения от гиперболического закона Михаэлиса-Ментен. Способы расчета
коэффициента Хилла: метод Хилла, метод Б. Курганова с соавторами. Модели
аллостерических ферментов. Согласованная модель Моно-Уаймена-Шанжё,
последовательная модель Немети-Кошланда-Филмера. Влияние аллостерических
эффекторов на кривую зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата. Совместное действие различных аллостерических эффекторов. Оценка
кооперативных свойств у аллостерических ферментов с помощью коэффициента крутизны –
Rх. Преимущества аллостерических ферментов с положительной кооперативностью по
сравнению с аллостерическими ферментами, проявляющими отрицательную
кооперативность, и ферментами, подчиняющимися кинетике Михаэлиса-Ментен в
регуляции метаболических путей в клетке.
Принципы регуляции ферментативных процессов. Локализация ферментов в клетке.
Понятие компартментализации на примере лизосомальных, митохондриальных ферментов.
