Биотехнология: Монография. Волова Т.Г. - 125 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

124
Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in
vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетиче-
ских структур в живую клетку.
В 1972 г. Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную моле-
кулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага
λ dvgal с галактозным опероном E. coli. Инструментом для генетического
конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эн-
донуклеазы (рестриктазы) и лигазы. Первые необходимы для получе-
ния однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестрик-
тазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обрат-
ной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение
всех генноинженерных
манипуляций.
Техника генетического конструирования in vitro включает несколько
последовательных процедур (рис. 4.1):
1) получение нужного гена;
2) встраивание его в генетический элемент, способный к репликации
(вектор);
3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;
4) идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели же-
лаемый ген или гены.
ДНК
ДНК
5’
5’
3’
3’
G
G
G
G
A
A
A
A
A
A
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
Эндонуклеаза
Эндонуклеаза
Расщепленная
плазмида
Рекомбинантная
плазмида
Введение
рекомбинантной
плазмиды
в кишечную
палочку
Плазмида
Чужеродный ген (ДНК)
Клонирование гена
Лигаза
Плазмиды
Хромосом
а
A
A
T
T
С
С
С
С
T
T
T
T
T
T
T
T
TT
TT
TT
TT
TT
TT
TT
TT
A
A
A
A
A
A
A
A
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
G
G
T
T
T
T
A
A
A
A
+
Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках
(по А. Сассону, 1987).
Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных
нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах,
комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с
помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон
, все клет-
ки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной
клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Страницы