Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 32 стр.

     Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две            гибридизации свободных нелигированных индикаторных
ситуации: лигирование зондов и отсутствие лигирования.     ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20
Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец       раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комп-
зонда X метят биотином, а 3'-конец зонда Y —               лементарны ДНК-мишени, то лигирование будет
дигоксигенином,     низкомолекулярным       соединением,   происходить в каждом цикле, и после 20 циклов
связывающимся с соответствующим антителом.                 накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых»
     После гибридизации и лигирования проводят             зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить
денатурацию         ДНК        для        высвобождения    с помощью электрофореза. Если комплементарность
гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в               неполная, то лигирование не произойдет и никаких
небольшую        пластиковую       лунку,      покрытую    продуктов зарегистрировано не будет.
стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь
материал, кроме связавшегося со стрептавидином
биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку
антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со
щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе
которого происходит удаление несвязанного конъюгата,
добавляют бесцветный хромогенный субстрат.
     Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о
связывании антитела к дигоксигенину с зондом,
меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был
лигирован с зондом, меченным биотином. Если же
окрашивания не происходит, значит лигирования не было.
   ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и
высокоспецифичным      методом.     Все    его   стадии
роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов
в день.
   Более простым, хотя и менее чувствительным
вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной
реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух
индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии
термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование
при 65 "С. затем повышают температуру до 94 °С, чтобы
произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд—
ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для