Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 30 стр.

проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет                флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в
необходимости в отдельном помещении для детекции                 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри
продуктов реакции.                                               амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое
                                                                 флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-
Использование математических методов анализа позволяет           положении блокирует полимеразу.
проводить автоматическую интерпретацию полученных
результатов и снимает проблему субъективной оценки                    В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров
электрофореграмм.                                                происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной
                                                                 цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации
Оборудование                                                     образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется
                                                                 с соответствующими ампликонами. Во время стадии
     Для постановки ПЦР в реальном времени необходим             элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь
специальный амплификатор, отличительной особенностью             ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять
которого является возможность возбуждать и детектировать         благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким
флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на              образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и
каждом цикле амплификации. На сегодня существует                 гасителя, что приводит к увеличению детектируемого
немного моделей приборов для ПЦР в реальном времени: это         свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было
"iQ iCycler" ("Bio-Rad"), несколько типов "ABI Prism"            наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем
("Applied Biosystems"), "LightCycler" ("Roche"), "SmartCycler"   интенсивнее будет свечение.
("Cepheid"). Каждый из этих приборов обладает рядом
достоинств и недостатков.                                        2. Использование зондов с комплементарными концевыми
                                                                 последовательностями (molecular beacons).
Детекция продуктов амплификации.
                                                                      Данная методика отличается от описанной выше тем,
     Для выявления продуктов амплификации в режиме               что концевые последовательности зонда представляют собой
реального времени используют следующие наиболее                  взаимно    комплементарные      области,   поэтому   при
распространенные подходы:                                        температуре отжига праймеров они схлопываются и
                                                                 образуют шпильки. Внутренняя область зондов содержит
1. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).                  нуклеотидную      последовательность,    комплементарную
                                                                 амплифицируемой области. При отжиге праймеров зонды, не
     Данная методика основана на использовании 5'-               присоединившиеся к ДНК матрице, остаются в "схлопнутом"
экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную              состоянии, так что происходит тушение флуоресценции. Те
смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит               же зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются,
флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель                   и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные