Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 31 стр.

стороны. Таким    образом, увеличивается    интенсивность                       5.4. Метод ПЦР/ЛОЗ
свечения.
                                                                   Для обнаружения однонуклеотидных замен применяют
3. Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии     подходы, объединяющие ПЦР и метод, основанный на
(LightCycler assay).                                         дотировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ) - ПЦР/ЛОЗ.
                                                                   Предположим, что в определенном сайте нормального
     Данный способ детекции накопления продуктов             гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том
амплификации отличается повышенной специфичностью, так       же сайте мутантного гена — G-C. Зная нуклеотидные
как     увеличение    флуоресценции    происходит     при    последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно
комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК       синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента,
зондов. Принцип метода заключается в переносе энергии от     прилегающих к данному сайту и комплементарных
одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда,   противоположным цепям.
ко второму флуорофору, находящемуся на 5` конце второго            Основная особенность этой пары олигонуклеотидов
зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-    состоит в том, что 3'-концевой нуклеотид одного из них (зонд
3 нуклеотида. При одновременном связывании обоих зондов с    X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м по-
ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение        ложении нормальной последовательности, а 5'-концевой
передается на второй флуорофор, а его излучение              нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду,
детектируется прибором. Таким образом, возрастает            примыкающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих
специфичность анализа.                                       зондов с содержащей нормальную последовательность
                                                             ДНК-мищенью        (амплифицированной      методом     ПЦР)
4. Использование интеркалирующих агентов.                    происходит их полная гибридизация, и при добавлении в
                                                             реакционную смесь ДНК-лигазы зонды X и Y ковалентно
     Этот способ детекции основан на том факте, что          сшиваются. Если же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК,
флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I               в которой произошла замена 106-го нуклеотида то
значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные     некомплементарный ему 3'-концевой нуклеотид зонда X не
молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за              может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему
накоплением продуктов амплификации. Очень важно              гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды
отметить то, что увеличение флуоресценции может быть         X и Y.
связано как с накоплением специфического продукта, так и           Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные
неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения      зонды, полностью соответствующие последовательности с
корректных    результатов   необходимо     дополнительное    мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе
изучение полученных ампликонов с помощью построения так      зондов лигирование будет происходить в случае их
называемых "кривых плавления" (melting curves).              отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае
                                                             отжига с нормальной мишенью.