ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
с помощью ультрафиолетовых ламп не менее 20 мин. Все
оборудование и расходные материалы, предназначенные
непосредственно для ПЦР (амплификатор,
микроцентрифуга-вортекс, комплект автоматических
дозаторов, штатив с наконечниками, штатив для пробирок),
запрещается использовать для других
работ.
1. Извлечь из пакета необходимое количество
пробирок «ПЦР ядро» синего цвета по числу
анализируемых проб, а также бесцветную пробирку для
отрицательного контроля и пробирку красного цвета для
положительного контроля, разместить их в штативе и
промаркировать.
2. Добавить в каждую пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл
ПЦР растворителя.
3. Добавить в пробирки «ПЦР ядро» синего цвета по
10 мкл анализируемых проб ДНК.
4. Добавить в бесцветную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл
буфера ТЕ.
5. Добавить в красную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл
буфера ТЕ. NB! Наконечники для автоматической
пипетки при переходе от пробы к пробе следует
использовать однократно! Манипуляции с красными
пробирками положительного контроля рекомендуется
проводить в последнюю очередь.
7. Перемешать содержимое пробирок «ПЦР ядро»
путем встряхивания на вортексе до полного растворения
сухой смеси. Жидкость в пробирке должна равномерно
окраситься в синий цвет.
8. Центрифугировать пробирки 5-7 сек при 2 тыс.
об/мин. При этом отдельные капли ПЦР смеси, оказавшиеся
при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки,
должны быть сброшены на дно.
9. В каждую пробирку прибавить 20-25 мкл (2 капли)
минерального масла.
10. Пробирки с готовой ПЦР смесью поместить
в амплификатор и запустить программу
амплификации (см. табл.) (контроль над
температурой рекомендуется
осуществляться в режиме Tube или Sim):
Этапы
ПЦР
К
оличе
ство
Название набора реагентов
ц
иклов
BOV-
ПЦР ядро
SUS-ПЦР ядро GUL-ПЦР
ядро
Цикл 1 1 94°С - 3 минуты
Цикл 2 35 94°С - 30
сек, 63°С -
30 сек, 72°С
94°С -30 сек,
65°С -30 сек,
72°С -30 сек
94°С -30 сек.
63°С -30 сек,
72°С - 30 сек
Цикл 3 1 72°С - 3 минуты
NB! Использование для ПЦР амплификаторов других
моделей может потребовать изменения времени
каждого шага (в зависимости от скорости нагрева-
охлаждения) и/или изменения на 1-2°С температуры
отжига праймеров.
11. Извлечь пробирки из амплификатора,
поместить в штатив и перенести в комнату для
детекции продуктов ПЦР.
ЭТАП 3 . ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР И АНАЛИЗ
ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проводится аналогично методики обнаружения
трансгенной ДНК в растениях и продуктах их
переработки.
Контрольные вопросы :
с помощью ультрафиолетовых ламп не менее 20 мин. Все 10. Пробирки с готовой ПЦР смесью поместить
оборудование и расходные материалы, предназначенные в амплификатор и запустить программу
непосредственно для ПЦР (амплификатор, амплификации (см. табл.) (контроль над
микроцентрифуга-вортекс, комплект автоматических температурой рекомендуется
дозаторов, штатив с наконечниками, штатив для пробирок), осуществляться в режиме Tube или Sim):
запрещается использовать для других
работ.
Этапы Количе Название набора реагентов
1. Извлечь из пакета необходимое количество
ПЦР ство
пробирок «ПЦР ядро» синего цвета по числу
анализируемых проб, а также бесцветную пробирку для BOV- SUS-ПЦР ядро GUL-ПЦР
циклов ПЦР ядро ядро
отрицательного контроля и пробирку красного цвета для
Цикл 1 1 94°С - 3 минуты
положительного контроля, разместить их в штативе и
промаркировать. Цикл 2 35 94°С - 30 94°С - 30 сек, 94°С - 3 0 сек.
сек, 63°С - 65°С - 30 сек, 63°С - 3 0 сек,
2. Добавить в каждую пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл 3 0 сек, 72°С 72°С -30 сек 72°С - 30 сек
ПЦР растворителя. Цикл 3 1 72°С - 3 минуты
3. Добавить в пробирки «ПЦР ядро» синего цвета по
10 мкл анализируемых проб ДНК.
4. Добавить в бесцветную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл NB! Использование для ПЦР амплификаторов других
буфера ТЕ. моделей может потребовать изменения времени
5. Добавить в красную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл каждого шага (в зависимости от скорости нагрева-
буфера ТЕ. NB! Наконечники для автоматической охлаждения) и/или изменения на 1-2°С температуры
пипетки при переходе от пробы к пробе следует отжига праймеров.
использовать однократно! Манипуляции с красными 11. Извлечь пробирки из амплификатора,
пробирками положительного контроля рекомендуется поместить в штатив и перенести в комнату для
проводить в последнюю очередь. детекции продуктов ПЦР.
7. Перемешать содержимое пробирок «ПЦР ядро»
путем встряхивания на вортексе до полного растворения ЭТАП 3 . ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР И АНАЛИЗ
сухой смеси. Жидкость в пробирке должна равномерно ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
окраситься в синий цвет. Проводится аналогично методики обнаружения
8. Центрифугировать пробирки 5-7 сек при 2 тыс. трансгенной ДНК в растениях и продуктах их
об/мин. При этом отдельные капли ПЦР смеси, оказавшиеся переработки.
при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки,
должны быть сброшены на дно.
9. В каждую пробирку прибавить 20-25 мкл (2 капли)
минерального масла. Контрольные вопросы :
