Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В - 35 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВСГУТУ | Улан-Удэ

Составители: 

Рубрика: 

об./мин.
12. Надосадочную жидкость удалить при помощи
автоматической пипетки или насоса с колбой-ловушкой, не
задевая при этом осадка.
13. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 2,
содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного
суспендирования осадка.
14. Центрифугировать пробы 20 сек при 2 тыс. об./мин.
Надосадочную жидкость удалить как описано в п. 13.
15. Повторить операции, изложенные в пп. 13 и 14.
NB! В последний раз надосадочную жидкость
необходимо удалить наиболее полно, не задевая при этом
осадка.
16. Пробирку открыть и, поместив в термостат, сушить
осадок5-7 мин при
65°С.
17. К высушенному осадку добавить 75 мкл буфера ТЕ.
Пробирку закрыть.
18. Встряхивать содержимое пробирки на вортексе до
полного суспендирования осадка.
19. Термостатировать пробирки при 65°С в течение 10
мин. По окончании термостатирования содержимое пробирки
вновь центрифугировать на вортексе.
20. Центрифугировать пробы 1 мин при 10 тыс. об./мин.
21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) перенести в
чистую пробирку, не
задевая при этом осадка. Хранить полученный экстракт ДНК
при -20°С, а при частом
использовании - при +4°С.
NB! Надосадочная жидкость используется в качестве
пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания в
нее сорбента!
ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА ПЦР
(АМПЛИФИКАЦИЯ)
Принцип действия
Для проведения полимеразной цепной реакции
(ПЦР) предлагается готовая универсальная смесь
всех необходимых компонентов, разнесенная по
отдельным
пробиркам 0,5 (0,2) мл. К ней прилагается
комплект жидких реагентов (ПЦР-растворитель и
минеральное масло), которые добавляют пробирки
непосредственно перед употреблением.
Отличительной чертой каждого из разработанных
наборов являются праймеры BOV, SUS и GAL,
предназначенные для амплификации целевых
фрагментов, специфичных по отношению к ДНК
коровы, свиньи и курицы, соответственно.
Получение специфических продуктов амплификации
BOV, SUS или GAL означает, что исследуемая проба
содержит ДНК коровы, свиньи или курицы,
соответственно.
Для повышения достоверности получаемых
результатов и исключения возможных ошибочных
выводов амплификацию проб ДНК рекомендуется
проводить в троекратной повторности. При этом не
требуется повторное проведение пробоподготовки,
поскольку ДНК, выделенной из одного образца,
достаточно, как минимум, для 15 реакций.
Протокол проведения полимеразной цепной
реакции (только при использовании набора
реагентов серии «ПЦРядро»)
Перед началом работы продезинфицировать
помещение для ПЦР, ламинарный шкаф или УФ-бокс 
       об./мин.                                                                     (АМПЛИФИКАЦИЯ)
      12. Надосадочную жидкость удалить при помощи
автоматической пипетки или насоса с колбой-ловушкой, не                             Принцип действия
задевая при этом осадка.                                             Для проведения полимеразной цепной реакции
      13. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 2,               (ПЦР) предлагается готовая универсальная смесь
содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного          всех необходимых компонентов, разнесенная по
суспендирования осадка.                                         отдельным
      14. Центрифугировать пробы 20 сек при 2 тыс. об./мин.          пробиркам 0,5 (0,2) мл. К ней прилагается
Надосадочную жидкость удалить как описано в п. 13.              комплект жидких реагентов (ПЦР-растворитель и
      15. Повторить операции, изложенные в пп. 13 и 14.         минеральное масло), которые добавляют пробирки
      NB! В последний раз надосадочную жидкость                 непосредственно перед употреблением.
необходимо удалить наиболее полно, не задевая при этом                Отличительной чертой каждого из разработанных
осадка.                                                          наборов являются праймеры BOV, SUS и GAL,
      16. Пробирку открыть и, поместив в термостат, сушить       предназначенные     для   амплификации     целевых
осадок5-7                       мин                       при    фрагментов, специфичных по отношению к ДНК
65°С.                                                            коровы, свиньи и         курицы, соответственно.
      17. К высушенному осадку добавить 75 мкл буфера ТЕ.        Получение специфических продуктов амплификации
Пробирку закрыть.                                                BOV, SUS или GAL означает, что исследуемая проба
      18. Встряхивать содержимое пробирки на вортексе до         содержит ДНК коровы, свиньи или курицы,
полного суспендирования осадка.                                  соответственно.
      19. Термостатировать пробирки при 65°С в течение 10             Для повышения достоверности получаемых
мин. По окончании термостатирования содержимое пробирки          результатов и исключения возможных ошибочных
вновь центрифугировать на вортексе.                              выводов амплификацию проб ДНК рекомендуется
      20. Центрифугировать пробы 1 мин при 10 тыс. об./мин.      проводить в троекратной повторности. При этом не
      21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) перенести в       требуется повторное проведение пробоподготовки,
чистую                      пробирку,                      не    поскольку ДНК, выделенной из одного образца,
задевая при этом осадка. Хранить полученный экстракт ДНК         достаточно, как минимум, для 15 реакций.
при            -20°С,         а         при            частом
использовании - при +4°С.
      NB! Надосадочная жидкость используется в качестве           Протокол проведения полимеразной цепной
пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания в                реакции (только при использовании набора
нее сорбента!                                                            реагентов серии «ПЦРядро»)
                                                                    Перед началом работы продезинфицировать
                    ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА ПЦР                      помещение для ПЦР, ламинарный шкаф или УФ-бокс

Страницы