Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 18 стр.

                                  18
      Принципы метода ПЦР. Техника амплификации фрагментов ДНК с
помощью полимеразной цепной реакции, которая революционизировала
существующие методы молекулярного анализа геномов, была предложена
в 1985 г. Кэри Мюллисом, за разработку которой в 1993г. ему была прису-
ждена Нобелевская премия. Полимеразная цепная реакция имитирует при-
родный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК – репликацию, проис-
ходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с уча-
стием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваива-
ется вся ДНК, то при ПЦР – происходит многократное копирование (вос-
произведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специ-
фического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя прайме-
рами.
      Комплементарное достраивание нитей начинается в определенных
стартовых точках, положение которых определяется затравками = прайме-
рами. Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, включающие около 20
нуклеотидов, каждый из которых комплементарен и будет гибридизиро-
ваться с одной из двух цепей на противоположных концах подлежащего
амплификации фрагмента ДНК. Праймеры ориентированы таким образом,
что синтез ДНК происходит только между ними, т.к. затравки комплемен-
тарны последовательностям ДНК на левой и правой границе амплифици-
руемого фрагмента. 3’-концы праймеров направлены навстречу друг другу
на амплифицируемый участок (ДНК-мишень). Т.е. праймеры как бы “за-
пирают” с двух сторон фрагмент, который должен быть многократно удво-
ен (рисунок 6).
      Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq - полимеразы) у
обитающих в горячих источниках бактерий Thermis aquaticus, позволили
сделать процесс амплификации ДНК циклическим и использовать его для
работы in vitro. Этот процесс автоматизирован и осуществляется с помо-
щью специального прибора (термоциклера =амплификатора), который по
заданной экспериментатором программе проводит серию многократно по-
вторяющихся циклов (20-30 циклов) и осуществляет быструю смену тем-
ператур.
      Каждый цикл ПЦР включает три кратковременных этапа, протекаю-
щих в различных температурных режимах (рисунок 6).
      1 этап. Денатурация ДНК. Кратковременное нагревание нативной
ДНК приводит к изменению ее физико-химических свойств, в частности,
вязкости, происходит разрушение водородных связей, соединяющих ком-
плементарные цепи, и разъединение цепей исходной молекулы ДНК. В
таком состоянии каждая цепочка может служить матрицей для реплика-
ции. Протекает при 93-950С в течение 30-40 сек.
      2 этап. Присоединение праймеров (отжиг) при охлаждении реакци-
онной смеси. Присоединение праймеров происходит комплементарно к
соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК
на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров сущест-