Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 32 стр.

                                 32
      К физическим картам низкого разрешения относятся карты кДНК.
      Карты кДНК. Карты кДНК отражают положение экспрессирую-
щихся участков ДНК (экзонов) относительно известных цитогенетических
маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты да-
ют представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в
том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использо-
ваны для поиска новых генов. Этот подход особенно полезен при поиске
генов, повреждения которых вызывают заболевания человека, в том случае
если приблизительная локализация таких участков хромосом уже предва-
рительно проведена на генетических картах сцепления.
      Карты высокого разрешения. Для построения карт генома челове-
ка высокого разрешения экспериментально реализуются два альтернатив-
ных подхода: картирование сверху вниз (top-down mapping) и картирова-
ние снизу вверх (bottom-up mapping), рисунок 13.
      При картировании сверху вниз (рисунок 13А) исходным в анализе
является препарат ДНК индивидуальной хромосомы человека. ДНК разре-
зается крупнощепящими рестриктазами (например NotI) на длинные фраг-
менты, которые после разделения электрофорезом в пульсирующем поле
(пульс-электрофорез), подвергаются дальнейшей обработке другими рест-
риктазами.
      Методом электрофореза под действием однонаправленного постоян-
ного поля в агарозном или полиакриламидном (ПААГ) гелях удается раз-
делить фрагменты ДНК размером не более 30-50 тпн. Этот метод успешно
используется для картирования малых геномов. Продвижение больших
фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления элек-
трического поля происходит за счет конформационных изменений, обу-
словленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент пере-
ключения направления поля. В этом случае удается разделить молекулы
ДНК размером от 50 тпн до 10 млн пн).
      В результате получают макрорестрикционную карту, на которой
достаточно полно представлены все последовательности исследуемой
хромосомы или ее части, однако ее разрешение невысоко. На такой карте
очень трудно локализовать индивидуальные гены. К тому же каждая инди-
видуальная карта редко охватывает протяженные сегменты ДНК (как пра-
вило, не более 1–10 млн пн).
      Для картирования генома человека снизу вверх (рисунок 13А) инди-
видуальную хромосому разрезают на множество небольших случайных
фрагментов (размером 10–1000 тпн), часть из которых перекрывается друг
с другом. Затем их клонируют и упорядочивают. В качестве вектора для
клонирования в этом случае часто используют искусственные минихромо-
сомы бактерий (BAC) или дрожжей (YAC). Порядок расположения клонов,
содержащих частично перекрывающиеся участки, определяют с помощью
процедуры “прогулка по хромосоме”. Каждый раз отобранный фрагмент
используется в качестве ДНК-зонда для последующего поиска. В ре -