Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 30 стр.

                                  30

      1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура “Прогулка по хромосоме”
       Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонирован-
ных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить
участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибриди-
зации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последователь-
ность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохро-
мом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библио-
тек клонов.
      К упорядоченным библиотекам клонов относят карты контиг. Для
их создания необходимо получить и клонировать небольшие участки ДНК
и определить их нуклеотидные последовательности. Это так называемый
STS (sequence tagget site) – ДНК-маркирующий сайт – уникальная для дан-
ного локуса последовательность. Затем STS упорядочивают, создавая про-
тяженные участки ДНК. Это и есть контиги – группы клонов, охватываю-
щие перекрывающиеся участки генома. Упорядочение расположения кло-
нов осуществляют с помощью процедуры, известной как “прогулка по
хромосоме”, предложенной в 1979 г. Б. Бендером, П. Спирером и Д. Хог-
нессом.
      “Прогулка по хромосоме” (скользящее зондирование). Для упоря-
дочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, по-
лученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя раз-
ными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиоте-
ке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-
маркирующий сайт – STS), он затем может быть использован в качестве
зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А
изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для
другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д. Так, оты-
скивая клон за клоном, можно передвигаться по хромосоме шагами длиной
до 30000 пн (рисунок 12).
      Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на
хромосоме.

      1.4.3. Стратегии построения физической карты высокого разре-
шения
      Физические карты различаются по степени их разрешения, т.е. по
тем деталям структуры генома, которые на них представлены. Исчерпы-
вающая физическая карта генома человека максимального разрешения бу-
дет содержать полную нуклеотидную последовательность всех его хромо-
сом. На другом полюсе физических карт с минимальным разрешением на-
ходятся хромосомные (цитогенетические) карты генома. Принцип их по-
строения был рассмотрен в разделе 1.1.