Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 29 стр.

                                  29
вместном гидролизе двумя рестриктазами получаются 3 фрагмента: 2,5; 2,0
и 0,5 тпн, на основании чего строится рестрикционная карта.
       В реальных экспериментах построение рестрикционных карт - го-
раздо более сложный процесс.
       Построение рестрикционных карт хромосом – обязательный предва-
рительный этап секвенирования (определения последовательности нуклео-
тидов). Зная взаимное расположение перекрывающихся фрагментов ДНК,
можно восстановить последовательность нуклеотидов в более крупных
фрагментах, а затем во всей хромосоме и в геноме в целом.
       Первая рестрикционная карта была получена для вируса SV-40 (он-
когенный обезьяний вирус), затем – бактериофага λ.
       Банк генов. Для рестрикционного картирования фрагменты ДНК,
полученные с помощью определенных рестриктаз или при воздействии на
нее ультразвуком (так называемым методом дробовика или шот-ган мето-
дом), используют для создавая геномых библиотек разных видов, или бан-
ков генов.
       Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным
молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве
векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие
бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага λ и
бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага λ, который
обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК,
включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бакте-
риофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосо-
мы дрожжей YAK – (ЯК) и бактерий BAC – (БАК) хромосомы.
       Векторные молекулы с включенными в них фрагментами чужерод-
ной ДНК, т.е. рекомбинантные ДНК (рекДНК) вводят в реципиентные бак-
терии, где они реплицируются автономно или вместе с ДНК бактерии-
реципиента после интеграции с ее геномом (хромосомой).
       Клонирование (многократную репликацию) фрагментов ДНК прово-
дят с целью получения большого числа копий фрагментов, идентичных
исходному. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют
плазмиды, фаговые ДНК, а для крупных - космиды и искусственные хро-
мосомы. Искусственные хромосомы дрожжей (YAK-хромосомы) позволя-
ют клонировать фрагменты ДНК человека размером до 1Мб.
       Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом
или их частей, называют хромосомными библиотеками.
       Создают также библиотеки кДНК, т.е. копий ДНК, комплементарных
мРНК. Поскольку комплементарную ДНК получают из зрелых молекул
мРНК, претерпевших процессинг, молекулы кДНК не содержат интронов.
Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из кото-
рых она была выделена. Создание таких библиотек полезно при сравнении
генной активности в клетках разных тканей. Ее также используют для ре-
стрикционного картирования и определения нуклеотидных последователь-
ностей фрагментов ДНК.