Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 28 стр.

                                     28
      1.4.1. Создание рестрикционных карт
      Рестрикционное картирование основано на установлении точек
действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции пред-
ставляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и мо-
жет использоваться для его идентификации.
      Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает
один и тот же набор фрагментов. Для построения рестрикционной карты
определенного района хромосомы используют несколько ферментов рест-
рикции и сначала обрабатывают (расщепляют) ДНК каждой из рестриктаз
в отдельности, а затем их комбинациями. Определив размер полученных
фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно установить порядок
следования сайтов рестрикции вдоль анализируемой молекулы ДНК. Т.е.
молекулу ДНК постепенно расщепляют на все меньшие и меньшие фраг-
менты, получая перекрывающиеся фрагменты (имеющие общие концы) и
затем установливают последовательность самих фрагментов относительно
друг друга в геноме. На рестрикционной карте будут показаны места рест-
рикции каждой нуклеазы по отношению к местам рестрикции других нук-
леаз (рисунок 11).
                                          5,0

                      0,5                       4,5
      Eco RI


      Bam HI                   3,0                          2,0

      Eco RI +        Eco RI                     Bam HI
      Bam HI
                  0    0,5                            3,0         5,0

     Рисунок 11. Пример построения рестрикционной карты по сайтам
рестрикции Eco RI и Bam HI [Жимулев, 2002]:
Числа – расстояние между сайтами узнавания соответствующих ферментов (тпн)

      Например, клонирован фрагмент ДНК длиной 5 тпн. Одну партию
(аликвоту) ДНК обрабатывают рестриктазой EcoRI, другую – Bam HI, тре-
тью – смесью обеих рестриктаз. После гель-электрофореза определяют
размеры фрагментов, сопоставляя их с размерами маркерных макромоле-
кул с известными молекулярными массами. При гидролизе ДНК рестрик-
тазой EcoRI образуются два фрагмента размером 4,5 и 0,5 тпн. Это свиде-
тельствует о наличии только одного сайта рестрикции и этот сайт находит-
ся на расстоянии 0,5 тпн от одного из концов исходного фрагмента. По
этой же логике есть только один сайт узнавания при гидролизе рестрикта-
зой Bam HI, удаленный на 3 тпн от одного из концов (рисунок 11). При со-