Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 27 стр.

                                  27
      Суть метода в следующем. Из биологического материала (капли кро-
ви, спермы, нескольких луковиц волос) выделяют ДНК, амплифицируют и
разрезают рестриктазами. Фрагменты ДНК денатурируют (делают однони-
тевыми) и подвергают электрофорезу в полиакриламидном (ПААГ) или
агарозном геле, где они разделяются по длине.
      В электрическом поле фрагменты ДНК движутся от отрицательного
к положительному полюсу со скоростью, зависящей от длины (массы)
фрагмента. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее они движутся и
дальше продвигаются вниз по гелю. В результате электрофореза в геле об-
разуется ряд полос, расположенных одна под другой. Верхние полосы со-
ответствуют фрагментам, имеющим более крупные размеры, а нижние –
фрагментам с более мелкими размерами. По окончании электрофореза на
гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, на который молекулы ДНК
переносятся и там закрепляются (иммобилизируются) в той же последова-
тельности, что они были расположены в геле. На таком фильтре проводит-
ся гибридизация ДНК с помеченным радиоактивно зондом Джеффриса
(гибридизация in situ). На рентгеновской пленке, наложенной на нитроцел-
люлозный фильтр, радиоактивно меченая ДНК будет засвечивать эмуль-
сию в местах, где произошла гибридизация ДНК с зондом. В итоге на
электрофореграмме получится рисунок из нескольких десятков темных
полос, на разном расстоянии от начала движения. Каждая из таких полос
соответствует отдельному участку мини-сатДНК, а их число, размещение
и интенсивность составляют рисунок сугубо индивидуальный для каждого
человека. Подсчитано, что вероятность его повторения у двух неродствен-
ных индивидов 1 на 1 млрд., кроме однояйцевых близнецов. Некоторое, но
далеко не полное совпадение наблюдается также у кровных родственни-
ков. Генная дактилоскопия по Джеффрису используется в криминалистике
и судебной медицине.

                    1.4. Физическое картирование

      В отличие от рассмотренных выше генетических карт сцепления фи-
зические карты генома отражают реальное расстояние между генами (или
маркерами), выражаемое числом пар нуклеотидов. Физическое картиро-
вание основано на прямом анализе молекул ДНК, составляющих каждую
хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель –
определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме. Физи-
чески картировать какой-либо ген или фрагмент на хромосоме означает
определить его положение на этой хромосоме в физических единицах - па-
рах нуклеотидов.
      Возможность физического картирования геномов появилась в связи с
развитием техники молекулярных маркеров ДНК. Физическое картирова-
ние включает создание рестрикционных карт и упорядоченных библиотек
клонов геномной ДНК. Важную роль при этом сыграло открытие рестрик-
таз.