Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 35 стр.

                                  35
      Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных
фрагментах ДНК, состоящих из 100-300 нуклеотидов, которые образуются
при расщеплении ДНК рестриктазами. Результаты секвенирования объе-
диняются затем в длинные цепочки нуклеотидных последовательностей на
хромосоме.
      Оба метода секвенирования сводятся к тому, чтобы получить серию
одноцепочечных молекул ДНК, различающихся по размеру на один нук-
леотид. Для этого используют два подхода: в одном случае ДНК химиче-
ски расщепляют (разрушают и укорачивают по одному основанию – хими-
ческая деградация); в другом случае (ферментативный способ) осуществ-
ляют удлинение цепи ДНК на одно основание, используя для этого тери-
минаторы синтеза. Полученные молекулы можно разделить с помощью
электрофореза, а результаты прочитать “с листа”.
      Рассмотрим более подробно ферментативный способ секвенирова-
ния. Его еще называют метод обрыва цепи (от англ. chain termination
method), рисунок 14.
      Секвенирование начинается с клонирования небольших рестрикци-
онных фрагментов ДНК, образуемых в результате рестрикции предвари-
тельно клонированных более крупных фрагментов.
      Фрагмент ДНК, подлежащий секвенированию, денатурируют до од-
нонитчатого состояния щелочной обработкой или нагреванием. Затем с
одной из нитей проводят гибридизацию (отжиг) с коротким олигонуклео-
тидным праймером, который связывается с 3′-концом однонитевой ДНК.
Олигонуклеотид (который служит праймером для достраивания цепи ДНК-
полимеразой) синтезируется таким образом, чтобы его 3′-конец был по-
следним перед секвенируемой последовательностью.
      Для каждого эксперимента по секвенированию ставят 4 реакции с
однонитчатой ДНК и прикрепленным к ней праймером. Каждая реакцион-
ная смесь содержит четыре нормальных предшественника ДНК – четыре
дезоксирибонуклеозидтрифосфата dNTP: dATP, dGTP, dTTP и dCTP, а
также ДНК-полимеразу. Предшественники метятся радиоактивно изото-
пами 32Р, 33Р или 35S или нерадиоактивно. Кроме этого, в реакционную
смесь добавляют один из четырех модифицированных предшественников
ДНК – дидезоксинуклеозидтрифосфаты ddNTP (в соотношении 100 dNTP
: 1 ddNTP), которые служат терминаторами синтеза: ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP. У этих нуклеотидов в 3′ положении находится -Н, а не -ОН (как у
дезоксинуклеотидов). Так как предшественники (нуклеотиды) модифици-
рованы, то можно присоединить только одно основание и рост цепи пре-
кращается (фосфодиэфирная связь не образуется, т.к. –ОН отсутствует).
      Затем с помощью ДНК-полимеразы ведут синтез второй компле-
ментарной цепи ДНК. Остановка синтеза (обрыв цепи) будет происходить
всякий раз, когда вместо dNTP в растущую цепь ДНК будет встраиваться
соответствующий ему ddNTP. Поэтому среди продуктов реакции будет
множество фрагментов, различающихся по длине, так как синтез их начи-
нается с фиксированной точки (от праймера), а кончается в положении од-