Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений. Учебно-методическое пособие. Часть 2. Цыренов В.Ж. - 13 стр.

     В качестве источника БАВ используют каллусную ткань, ко-      небольшие агрегаты (по 5-10 клеток). Более пригодна каллусная
торую получают твердофазным способом культивирования и глу-        ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные
бинным суспензионным культивированием, осуществленным в пе-        клетки и небольшие агрегаты при перемешивании её в нере…..
риодическом и непрерывном (проточном) режимах (Чуегов и др.,       жидкую среду. Трансплантат желательно обрабатывать пектина-
2003).                                                             зой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2,4-
                                                                   дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы Ca. При
     2.4.1. Твердофазный способ культивирования.                   подборе среды культивирования важно из среды исключить цито-
     Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных         кинины или снижать их концентрацию, а концентрацию ауксинов
органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в пита-       увеличивать.
тельную среду (пробирки, колбы, чашки Петри). Соблюдают стро-            Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два
гую стерильность.                                                  слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы
     Чтобы обеспечить развитие каллусных клеток в питательных      отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплан-
средах (табл. 2), содержащих необходимые для роста вещества,       тата. На образование клеточных агрегатов также сказывает влия-
клетки тканей, запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла     ние интенсивность перемешивания среды, так как клетки чрезвы-
листа и других тканей должны терять способность дифференци-        чайно чувствительны и быстро лизируются. Большинство клеток
ровки. Недифференцированному развитию клеток способствует          погибает.
прединкубация эксплантов на среде без гормонов в течение 3-6 су-         Суспензионные культуры, как правило, состоят из отдельных
ток.                                                               клеток, варьирующих по форме и размеру, и неоднородных много-
     Через 4-6 недели культивирования трансплантанта возникает     клеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких аг-
первичный каллус, который необходимо перенести на свежую пи-       регатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения
тательную среду. При культивировании на агаризованных средах       и условий культивирования.
кусочек каллуса должен иметь массу 60-100 мг на 30-40 мл свежей          В процессе культивирования активно делящиеся клетки не
среды. Каллусная ткань, вырасшая на поверхности твердой пита-      только поглощают питательные вещества, но и выделяют продук-
тельной среды, имеет аморфную структуру, представляющую со-        ты собственной жизнедеятельности, в том числе и ферменты: α-
бой массу тонкостенных пареахимных клеток. Химический состав       амилаза, фосфогидролаза и др. они изменяют дисперсность сус-
каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответст-      пензии. Повышать дисперсность суспензионных культур можно
вующего органа растения.                                           добавлением в среду низких концентраций пектиназы и целлюло-
     Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный      зы. При управлении процессом выращивания клеток важно иметь
для данного растения цикл развития, т.е. начинается дифферен-      гомогенную систему.
циация. Этот процесс регулируют гормоны.                                 Глубинное культивирование можно осуществлять в колбах
                                                                   на качалках при частоте вращения 100-120 об/мин. На 60-100 мл
     2.4.2. Глубинное суспензионное культивирование.               среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани, чтобы начальная
     Для глубинного культивирования и получения суспензион-        плотность клеточной популяции составила 0,5⋅105 – 2,5⋅105 кле-
ных культур необходимо использовать линии клеток, образующих       ток/мл среды. Сосуды с суспензией закрепляют на платформе тей-

                                                         27             28