Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений. Учебно-методическое пособие. Часть 2. Цыренов В.Ж. - 14 стр.

кера или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих ус-     окрашивании препаратов красителями: 0,5 %-ным раствором синей
ловиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса      Эванса или 0,01 %-ным раствором флуоресцеив-ацетата.
клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты. В ла-            Во многих случаях изучение особенностей размножения и
бораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100-250        роста клеток связано с необходимостью использования синхрони-
мл с небольшим объемом питательной среды.                           зированных клеточных популяций.
      Необходимо отметить, что растительные клетки растут и              Как правило, клеточная популяция суспензионных культур
размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганиз-        не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки,
мов. Время их удвоения 1-3сут. Процесс культивирования расти-       различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхрониза-
тельных клеток занимает 2-3 нед., что повышает требования к         ции клеточных культур используют методы индукции, когда тече-
обеспечению асептических условий.                                   ние клеточного цикла блокируется в определенном периоде под
      При выполнении работ с использованием культуры клеточ-        влиянием или физических факторов, например, пониженной тем-
ных суспензий необходимо знать их основные параметры.               пературой, или химических соединений.
      Плотность клеточной популяции - концентрация клеток в 1            Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых
мл суспензии.                                                       клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК - тимидин, 5-
      Минимальное время удвоения клеточной популяции в нако-        аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими
пительной суспензионной культуре. Например, время клеточного        веществами клеточный цикл продолжается только до G1-периода,
удвоения для сахарной свеклы составляет 86 часов, табака - 48 ча-   и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление
сов, фасоли - 22 часа.                                              из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу
      Вес сырого вещества суспензии определяют после помеще-        клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.
ния ее на предварительно взвешенный фильтр из нейлоновой тка-            Другой способ синхронизации заключается в создании усло-
ни и промывания водой для удаления остатков питательной среды.      вий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды
      Вес сухого вещества определяют после просушивания опре-       например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накап-
деленной навески сырой биомассы при 60-70 °С в течение суток.       ливаются в G1 или С2-периоде клеточного цикла.
      Количество клеток. Чтобы установить количество клеток в            Затем пассирование суспензии на среду с недостающим ком-
определенном объеме суспензии, необходимо диспергировать ее         понентом приводит к синхронизации клеточного деления.
содержимое до одноклеточного состояния обработкой 5-10% хро-             С помощью индукции синхронизации клеточных делений
мовой кислотой. Подсчет клеток проводят, используя 1 мл одно-       удается повысить митотический индекс с 2-3 % до 30-35 %.
клеточной суспензии, нанесенный на сетку счетной камеры.
      Размер клеток определяют их измерением под микроскопом с           Фазы ростового цикла в периодическом суспензионной
помощью шкалы окуляр-микрометра.                                    культуре.
      Жизнеспособность культуры определяют соотношением ко-              Ростовой цикл, или цикл выращивания - это период от помеще-
личества жизнеспособных клеток к общему количеству в милли-         ния инокулюма (части суспензионной культуры) на свежую среду до
литре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характе-         следующего субкультивирования.
ризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при

                                                          29              30