Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 10 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

10
2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и переме-
шать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1)
и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин.
Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.
3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин.
Верхнюю (водную) фазу перенести в новую
пробирку.
4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на
вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в
течение 10 мин.
5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезно-
вения следов спирта. Не пересушивать!!!
6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный
объём 12М LiCl и охладить раствор в
течение 30 мин при –20 °С.
7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной темпе-
ратуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.
8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деиони-
зованной воды, свободной от РНКаз.
9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.
Комментарии к методике:
1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации
РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, на-
сколько возможно.
2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если
ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым эти-
дием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать
полученный препарат РНК в дальнейшем.
3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объе-
мов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохра-
нен в течение нескольких лет в –20 °C. 
   2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и переме-
   шать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1)
   и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин.
   Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.
   3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин.
   Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку.
   4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на
   вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в
   течение 10 мин.
   5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезно-
   вения следов спирта. Не пересушивать!!!
   6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный
   объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С.
   7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной темпе-
   ратуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.
   8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деиони-
   зованной воды, свободной от РНКаз.
   9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.


Комментарии к методике:
1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации
   РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, на-
   сколько возможно.
2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если
   ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым эти-
   дием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать
   полученный препарат РНК в дальнейшем.
3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объе-
   мов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохра-
   нен в течение нескольких лет в –20 °C.

                                            10

Страницы