Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 12 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

12
13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H
2
O и 100 мкл 7.5M
NH
4
Ac (pH 7.5) и инкубировать 20 мин при 0
о
С.
14. Центрифугировать 13 000 rpm при 4
о
С 10 мин, добавить к суперна-
танту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при –70
о
С.
15. Центрифугировать 13 000 rpm при 4
о
С 10 мин, осадок сполоснуть
80 % этанолом;
16. Растворить в TE буфере или dH
2
O;
17. Хранить при –20
о
С.
Комментарии к методике:
1) Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в
ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифуж-
ных пробирок.
2) Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях
требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма.
Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий
1. Осадить клетки из 10 мл культуры центрифугированием 12 000 rpm
при 4
о
С 10 мин. Ресуспендировать в 10 мл буфера (15мМ Трис-HCI
рН 8.0, 0.45М сахароза, 8мМ ЭДТА), добавить 80 мкл (50мг/мл) ли-
зоцима и инкубировать на льду 15 мин.
2. Центрифугировать протопласты 5 мин 6 000 rpm при 4
о
С. Ресуспен-
дировать в 0.5 мл лизирующего буфера (10мМ Трис-HCI рН 8.0,
10мМ NaCI, 1мМ цитрат натрия, 1.5 % (w/v) SDS). Инкубировать
5 мин при 37
о
С, затем охладить на льду.
3. Добавить 250 мкл насыщенного хлорида натрия, перемешать. Инку-
бировать 10 мин на льду. 
   13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H2O и 100 мкл 7.5M
      NH4Ac (pH 7.5) и инкубировать 20 мин при 0 оС.
   14. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, добавить к суперна-
      танту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при –70 оС.
   15. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, осадок сполоснуть
      80 % этанолом;
   16. Растворить в TE буфере или dH2O;
   17. Хранить при –20 оС.


Комментарии к методике:
1) Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в
   ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифуж-
   ных пробирок.
2) Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях
   требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма.


Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий


   1. Осадить клетки из 10 мл культуры центрифугированием 12 000 rpm
      при 4 оС 10 мин. Ресуспендировать в 10 мл буфера (15мМ Трис-HCI
      рН 8.0, 0.45М сахароза, 8мМ ЭДТА), добавить 80 мкл (50мг/мл) ли-
      зоцима и инкубировать на льду 15 мин.
   2. Центрифугировать протопласты 5 мин 6 000 rpm при 4 оС. Ресуспен-
      дировать в 0.5 мл лизирующего буфера (10мМ Трис-HCI рН 8.0,
      10мМ NaCI, 1мМ цитрат натрия, 1.5 % (w/v) SDS). Инкубировать
      5 мин при 37 оС, затем охладить на льду.
   3. Добавить 250 мкл насыщенного хлорида натрия, перемешать. Инку-
      бировать 10 мин на льду.



                                       12

Страницы