Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 11 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

11
Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАB
1. Ткань растереть в ступке на холоде.
2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65
о
С пробирку с
2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI,
0.1М Tris-НCI, pH 8.0, 20mM ЭДТА, довести dН
2
О) на 2–5 г ткани),
очень хорошо и быстро перемешать.
3. Инкубировать при 65
о
С минимум 20 мин (лучше 1 час).
4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хло-
роформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить
инкубироваться на 20 мин.
5. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB –
5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dН
2
О), перемешать и инкубиро-
вать при 65
о
С 10 мин.
7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубиро-
вать 1 мин, периодически перемешивая.
8. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB –
1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, pH 8.0, 10mM ЭДТА, довести dН
2
О)
(можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнат-
ной температуре.
10. Центрифугировать 8 000 rpm при комнатной температуре 20 мин.
11. Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М Tris-
НCI, pH 8.0, 1mM ЭДТА, довести dН
2
О); добавить 2 объема 96 % эта-
нол и инкубировать 1 час при –20
о
С или 30 мин при –70
о
С.
12. Центрифугировать 8 000 rpm при 4
о
С 10 мин. 
Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАB


  1. Ткань растереть в ступке на холоде.
  2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65 оС пробирку с
     2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI,
     0.1М Tris-НCI, pH 8.0, 20mM ЭДТА, довести dН2О) на 2–5 г ткани),
     очень хорошо и быстро перемешать.
  3. Инкубировать при 65 оС минимум 20 мин (лучше 1 час).
  4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хло-
     роформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить
     инкубироваться на 20 мин.
  5. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
  6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB –
     5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dН2О), перемешать и инкубиро-
     вать при 65 оС 10 мин.
  7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубиро-
     вать 1 мин, периодически перемешивая.
  8. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
  9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB –
     1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, pH 8.0, 10mM ЭДТА, довести dН 2 О)
     (можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнат-
     ной температуре.
  10. Центрифугировать 8 000 rpm при комнатной температуре 20 мин.
  11. Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М Tris-
     НCI, pH 8.0, 1mM ЭДТА, довести dН2О); добавить 2 объема 96 % эта-
     нол и инкубировать 1 час при –20 оС или 30 мин при –70 оС.
  12. Центрифугировать 8 000 rpm при 4 оС 10 мин.


                                   11

Страницы