Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 13 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

13
4. Центрифугировать на максимальной скорости. Супернатант перене-
сти в новую пробирку и добавить 1 мл охлажденного 96 % этанола.
Инкубировать 30 мин при –70
о
С.
5. Центрифугировать 15 мин на максимальной скорости при 4
о
С. Про-
мыть осадок охлажденным 70 % этанолом и подсушить.
6. Растворить в подходящем объеме (40–100 мкл) деионизованной Н
2
О.
Хранит при –70
о
С.
Комментарии к методике:
1) После лизиса клеток образуется вязкая масса, поэтому необходимо осторожно от-
бирать водную фазу, чтобы исключить загрязнение НК белками.
2) приготовление насыщенного раствора хлорида натрия лучше осуществлять с ис-
пользованием DEPC-воды, что уменьшает риск внесения экзогенных нуклеаз.
3) Осаждение РНК 96% этанолом можно проводить и при –20
о
С, увеличив при этом
время инкубации до 1–1.5 часов.
Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использова-
нием наборов фирмы QIAEX II.
1. Вырезать фрагмент геля с ДНК, взвесить его и добавить 3 объема
буфера QX 1.
2. Размешать QIAEX II на вортексе 30 с. Прибавить 10–30 мкл
QIAEX II. Перемешать на вортексе.
3. Инкубировать 10 мин при 50
о
С. Мешать на вортексе каждые 2 ми-
нуты.
4. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, удалить супернатант.
5. К осадку добавить 500 мкл буфера QX 1 и перемешать на вортексе.
Центрифугировать 30 с, отобрать весь супернатант.
6. Добавить к осадку 500 мкл буфера PE. Перемешать на вортексе.
Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, отобрать весь супернатант. 
   4. Центрифугировать на максимальной скорости. Супернатант перене-
      сти в новую пробирку и добавить 1 мл охлажденного 96 % этанола.
      Инкубировать 30 мин при –70 оС.
   5. Центрифугировать 15 мин на максимальной скорости при 4 оС. Про-
      мыть осадок охлажденным 70 % этанолом и подсушить.
   6. Растворить в подходящем объеме (40–100 мкл) деионизованной Н2О.
      Хранит при –70 оС.


Комментарии к методике:
1) После лизиса клеток образуется вязкая масса, поэтому необходимо осторожно от-
   бирать водную фазу, чтобы исключить загрязнение НК белками.
2) приготовление насыщенного раствора хлорида натрия лучше осуществлять с ис-
   пользованием DEPC-воды, что уменьшает риск внесения экзогенных нуклеаз.
3) Осаждение РНК 96% этанолом можно проводить и при –20 оС, увеличив при этом
   время инкубации до 1–1.5 часов.


Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использова-
нием наборов фирмы QIAEX II.


   1. Вырезать фрагмент геля с ДНК, взвесить его и добавить 3 объема
      буфера QX 1.
   2. Размешать QIAEX II на вортексе 30 с. Прибавить 10–30 мкл
      QIAEX II. Перемешать на вортексе.
   3. Инкубировать 10 мин при 50 оС. Мешать на вортексе каждые 2 ми-
      нуты.
   4. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, удалить супернатант.
   5. К осадку добавить 500 мкл буфера QX 1 и перемешать на вортексе.
      Центрифугировать 30 с, отобрать весь супернатант.
   6. Добавить к осадку 500 мкл буфера PE. Перемешать на вортексе.
      Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, отобрать весь супернатант.
                                       13

Страницы