Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 33 стр.

чечные молекулы ДНК (см. рис. 4). В настоящее время красители SYBR
Green I и SYBR Gold признаны более чувствительными по сравнению с
бромистым этидием. В настоящее интеркалирующие агенты используются
для детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе и по завершению
ПЦР. Для этого добавляют краситель SYBR Green I в реакционную ПЦР-
смесь перед запуском ПЦР. Однако следует отметить то, что в данном слу-
чае увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением
специфического, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмеры)
продукта. В этой связи детекция продуктов ПЦР с помощью предвари-
тельного добавления интеркалирующих агентов в ПЦР-смесь требует до-
полнительного изучения полученных ампликонов с помощью построения
так называемых «кривых плавления». Кроме того, в ряде случаев возника-
ет необходимость нормализации сигнала флуоресценции красителя, ис-
пользуемого в реакции, что достигается использованием пассивного рефе-
ренсного красителя, например ROX.
     Принцип построения «кривых плавления» основан на том, что для
конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плав-
ления. Если мы будем повышать температуру раствора ДНК, то на каком-
то уровне средняя кинетическая энергия молекул окажется выше энергии
водородных связей, которыми скреплены половинки двойной спирали.
Температура, при которой распадается (денатурирует) половина молекул
ДНК, называется температурой плавления. В паре гуанин-цитозин (ГЦ)
три водородные связи, в паре аденин-тимин (АТ) только две. Поэтому чем
больше ГЦ в ДНК, тем более она «тугоплавка». Отсюда следует, что по
ширине интервала температур, в котором ДНК плавится, можно судить о
ее составе. «Кривые плавления» исследуют после окончания ПЦР, когда
реакционную смесь нагревают, и молекула флюорофора отщепляется от
ДНК, и ее флуоресценция резко снижается. Если в пробирке находятся ам-
пликоны с разной температурой плавления, то на кривой будет заметно не-
                                    33