Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 35 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

35
Компонент Конечная концентра-
ция
Количество компонента
на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл
10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл
Праймер 1 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл
Праймер 2 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл
SYBR Green 0.125 мкл
ROX 0.26 мкл
Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл
25мМ MgCI
2
5 мМ 10 мкл
ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концен-
трации образца
Деионизованная вода – до 50 мкл
3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и
запустить программу:
1.
Первичная денатурация ДНК при 95
о
С. Время денатура-
ции зависит от типа используемой матрицы.
2.
Денатурация цикла при 95
о
С 30 с.
3.
Отжиг праймеров при 60–65
о
С 20–30 с.
4.
Элонгация при 70–72
о
С 1 мин.
5.
Детекция флюорисцентного сигнала.
6.
Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 5) 30–40 раз.
7.
Построение кривых плавления в интервале от 60
о
C до
95
о
C с детекцией через каждые 0.2
о
C.
Комментарии к методике:
1) Поскольку краситель SYBR Green довольно быстро разлагается на свету, необходи-
мо все манипуляции совершать быстро и в затемненных пробирках.
2) Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига
должна быть как можно короче. Как правило, 15–20 с вполне достаточно для отжига
праймеров на специфическом субстрате.
3) Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не
больше 35–38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением.
4) При работе с SYBR Green необходимо строить кривую плавления ДНК для опреде-
ления специфичности ПЦР-реакции. 
Компонент                  Конечная концентра-        Количество компонента
                           ция                        на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер              1х                         5 мкл
10мМ смесь дНТФ            0.2 мМ каждого             1 мкл
Праймер 1 (5 мкМ)          0.1 мкМ                    1мкл
Праймер 2 (5 мкМ)          0.1 мкМ                    1мкл
SYBR Green                                            0.125 мкл
ROX                                                   0.26 мкл
Taq-ДНК-полимераза         1.25 ед.                   0.5 мкл
25мМ MgCI2                 5 мМ                       10 мкл
ДНК-матрица                0.1–1 мкг                  варьирует от концен-
                                                      трации образца
Деионизованная вода        –                          до 50 мкл
   3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и
      запустить программу:
         1.      Первичная денатурация ДНК при 95 оС. Время денатура-
                 ции зависит от типа используемой матрицы.
         2.      Денатурация цикла при 95 оС 30 с.
         3.      Отжиг праймеров при 60–65 оС 20–30 с.
         4.      Элонгация при 70–72 оС 1 мин.
         5.      Детекция флюорисцентного сигнала.
         6.      Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 5) 30–40 раз.
         7.      Построение кривых плавления в интервале от 60 оC до
                 95 оC с детекцией через каждые 0.2 оC.
Комментарии к методике:
1) Поскольку краситель SYBR Green довольно быстро разлагается на свету, необходи-
   мо все манипуляции совершать быстро и в затемненных пробирках.
2) Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига
   должна быть как можно короче. Как правило, 15–20 с вполне достаточно для отжига
   праймеров на специфическом субстрате.
3) Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не
   больше 35–38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением.
4) При работе с SYBR Green необходимо строить кривую плавления ДНК для опреде-
   ления специфичности ПЦР-реакции.
                                       35

Страницы