Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 36 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

36
Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов
Taqman
1)
Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.
2)
В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотно-
шениях:
Компонент Конечная концентра-
ция
Количество компонента
на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл
10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл
Праймер 1 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл
Праймер 2 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл
TaqMan 0.25 мкМ 1 мкл
Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл
25мМ MgCI
2
3.5 мМ 7 мкл
ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концентра-
ции образца
Деионизованная вода – до 50 мкл
3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и
запустить программу:
1.
Первичная денатурация ДНК при 95
о
С 10 мин.
2.
Денатурация цикла при 95
о
С 15 с.
3.
Отжиг праймеров с последующей элонгацией цепи при
60
о
С 1 мин.
4.
Детекция флюорисцентного сигнала.
5.
Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40–45 раз.
Комментарии к методике:
1) Поскольку при проведении такого типа реакции ПЦР-РВ используются специфиче-
ские типы полимераз (Pfu, Pwo и др.), их активность проявляется в диапазоне тем-
ператур 60–72
о
С.
2) Построение кривой плавления после реакции не обязательно (это будет кривая
плавления не ПЦР-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном). 
Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов
Taqman


   1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.
   2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотно-
      шениях:


Компонент                   Конечная концентра-         Количество компонента
                            ция                         на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер               1х                          5 мкл
10мМ смесь дНТФ             0.2 мМ каждого              1 мкл
Праймер 1 (5 мкМ)           0.1 мкМ                     1мкл
Праймер 2 (5 мкМ)           0.1 мкМ                     1мкл
TaqMan                      0.25 мкМ                    1 мкл
Taq-ДНК-полимераза          1.25 ед.                    0.5 мкл
25мМ MgCI2                  3.5 мМ                      7 мкл
ДНК-матрица                 0.1–1 мкг                   варьирует от концентра-
                                                        ции образца
Деионизованная вода         –                           до 50 мкл
   3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и
      запустить программу:
         1.      Первичная денатурация ДНК при 95 оС 10 мин.
         2.      Денатурация цикла при 95 оС 15 с.
         3.      Отжиг праймеров с последующей элонгацией цепи при
                 60 оС 1 мин.
         4.      Детекция флюорисцентного сигнала.
         5.      Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40–45 раз.

Комментарии к методике:
1) Поскольку при проведении такого типа реакции ПЦР-РВ используются специфиче-
   ские типы полимераз (Pfu, Pwo и др.), их активность проявляется в диапазоне тем-
   ператур 60–72 оС.
2) Построение кривой плавления после реакции не обязательно (это будет кривая
   плавления не ПЦР-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном).
                                        36

Страницы