Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 37 стр.

Работа 12. Обработка данных


     Детекция в реальном времени флюоресценции продуктов ПЦР по-
зволяет вычислять первоначальное количество присутствия шаблона в раз-
личных образцах. Осуществляется это путем подсчета числа циклов ПЦР,
необходимых для достижения заданного уровня флюоресценции (порого-
вой флюоресценции). В связи с тем, что интенсивность флюоресценции
отражает количество продукта, то для образцов, которые первоначально
имели больше матрицы, потребуются меньше циклов ПЦР для достижения
заданного порога флюорисценции, чем для образцов с меньшим количест-
вом матрицы. Такая взаимосвязь может быть задана математически: коли-
чество циклов, необходимых для достижения порога (то есть пороговый
цикл, или величина CT), обратно пропорционально логарифму первона-
чального количества матрицы. Поэтому значения CT могут использоваться
для расчета исходного количества матрицы.
     Для подсчета исходного количества матрицы в образце необходимо
сначала задать порог флюоресценции, при котором различные образцы бу-
дут сравниваться. Для этого сначала необходимо начертить зависимость
флюоресценции от номера цикла, а затем провести линию порога на гра-
фике в точке, где сигналы превосходят фоновые уровни и начинают увели-
чиваться экспоненциально. Величина CT для отдельного образца определя-
ется, как цикл, при котором линия флюоресценции образца пересекла ли-
нию порога.
     Значения CT, полученные в разных образцах, сравниваются с CT
стандарта для вычисления абсолютного или относительного количества
шаблона. Если величины количественного анализа образцов совпадают с
диапазоном матрицы, то можно сгенерировать линейную стандартную
кривую зависимости логарифма количества матрицы от CT. Абсолютное
количество исходной матрицы в неизвестных образцах затем может быть
                                  37