Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 41 стр.

           Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот


     В 1961 году было обнаружено, что процесс денатурации ДНК обра-
тим: после денатурации при 100 оС, выдерживание ДНК при температуре
65 оС привело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот про-
цесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации
происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементар-
ны: ДНК – ДНК, РНК – РНК, ДНК – РНК.
     Для проведения гибридизации необходимо иметь чистый одноцепо-
чечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, кото-
рую необходимо обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонировани-
ем, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая
в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15
до 1000 нуклеотидов.
    Анализ проводят по следующей схеме: исследуемую ДНК гидролизу-
ют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделен-
ные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибри-
дизации с мечеными олигонуклеотидами. Зонд метится какой-либо репор-
терной группой: радиоактивным изотопом, флуорохромом, ферментом,
дающим окрашенный или люминесцирующий продукт и т. д. Этот метод
был разработан Саузерном в 1975 году. «Блоттинг» – в переводе с англий-
ского означает «промокашка», «саузерн» – «южный».
    Молекулы исследуемой ДНК разгоняют в агарозном геле электрофо-
резом. ДНК в геле денатурируют щелочью. После переноса щелочь ней-
трализуют, и пластину геля накрывают нитроцеллюлозой. Сверху на нит-
роцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечи-
вая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпен-
дикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и


                                  41