Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 61 стр.

Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках
методом рестрикции


1. Рестрикцию вставки ДНК можно проводить любой рестриктазой,
  имеющей по одному сайту рестрикции с каждой стороны от вставки,
  например, EcoR I.
2. Собрать смесь для рестрикции:
       10х ПЦР буфер для EcoR I          –      1,5 мкл.
       Плазмидная ДНК                    –      1 мкг.
       Фермент EcoR I                    –      1 ед.
       Деионизованная вода               –      до 15 мкл.

3. Инкубировать смесь при 37 оС 30 мин. Инактивировать фермент нагре-
  ванием до 65 оС на 20 мин.

Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных
клетках методом ПЦР

1. При определении вставки можно использовать как секвенирующие
  праймеры М13, так и специфические праймеры для ДНК вставки.
2. В случае использования специфических праймеров для вставки ДНК,
  программа и параметры амплификации используются соответствую-
  щие.
3. Если использовать праймеры М13, то программа для амплификации
  следующая:
                               оо
         1) Денатурация при 95 оС 3 мин.
         2) Денатурация цикла при 95 оС 30 с.
         3) Отжиг праймеров при 50 оС 30 с.
         4) Элонгация цепи при 72 оС 40 с.
         5) Повторить цикл амплификации с п. 2. по п. 4. 30 раз.
         6) Финальная элонгация при 72 оС 3 мин.

                                    61