Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 59 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

59
Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью)
1.
1.5 мл культуры клеток поместить в 1.7 мл пробирку, центрифугиро-
вать 30 с при 10 000 rpm, полностью удалить супернатант (при необ-
ходимости повторить).
2.
Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора (25мМ Трис- HCI рН 8.0,
50мМ глюкоза, 10мМ ЭДТА
), перемешать на вортеке. Инкубировать
при комнатной температуре 5 мин.
3.
К суспензии добавить 400 мкл раствора (0.2Н NaOH, 1% ДСН), резко
вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз. Инкубиро-
вать при 0
o
С 5 мин (не больше!!!).
4.
Прибавить 200 мкл холодного 10М AcONH
4
, ~5 раз перевернуть.
Инкубировать при 0
o
С 5 мин.
5.
Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
5 мин.
6.
Супернатант перенести в пробирку с 500 мкл изопропанола, сме-
шать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
7.
Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
5 мин.
8.
К осадку прилить 100 мкл 2М AcONH
4
, перемешать на вортексе 20 с.
Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
9.
Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
5 мин., перенести супернатант в пробирку со 100 мкл изопропанола.
Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
10.
Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
10 мин, сполоснуть осадок 70 % этанолом, подсушить. При необхо-
димости обработать РНКазой.
11.
Растворить осадок в 25 мкл (H
2
0 или TE буфера). 
Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью)


  1. 1.5 мл культуры клеток поместить в 1.7 мл пробирку, центрифугиро-
     вать 30 с при 10 000 rpm, полностью удалить супернатант (при необ-
     ходимости повторить).
  2. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора (25мМ Трис- HCI рН 8.0,
     50мМ глюкоза, 10мМ ЭДТА), перемешать на вортеке. Инкубировать
     при комнатной температуре 5 мин.
  3. К суспензии добавить 400 мкл раствора (0.2Н NaOH, 1% ДСН), резко
     вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз. Инкубиро-
     вать при 0 oС 5 мин (не больше!!!).
  4. Прибавить 200 мкл холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть.
     Инкубировать при 0 oС 5 мин.
  5. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
     5 мин.
  6. Супернатант перенести в пробирку с 500 мкл изопропанола, сме-
     шать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
  7. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
     5 мин.
  8. К осадку прилить 100 мкл 2М AcONH4, перемешать на вортексе 20 с.
     Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
  9. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
     5 мин., перенести супернатант в пробирку со 100 мкл изопропанола.
     Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
  10. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm
     10 мин, сполоснуть осадок 70 % этанолом, подсушить. При необхо-
     димости обработать РНКазой.
  11. Растворить осадок в 25 мкл (H20 или TE буфера).



                                    59

Страницы