Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 58 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

58
c) Реакцию лигирования проводить при температуре 16
о
С в течение
30–40 мин.
2)
Оттаять во льду 0.5 M β-меркаптоэтанол и аликвоту компетентных
клеток.
3)
К аликвоте компетентных клеток добавить: 4 мкл 0.5M
β-меркаптоэтанола и 2 мкл пДНК;
4)
Инкубировать смесь при 0
o
C 20–60 мин.
5)
Быстро, но без встряхивания, перенести клетки на 42
o
C. Инкубиро-
вать 30 с.
6)
Быстро перенести в лед на 2 мин.
7)
После охлаждения к аликвоте клеток добавить 400 мкл буфера
(
2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10мМ NaCI, 10мМ KCI).
8)
Выращивать, перемешивая горизонтально на бактериальном шейке-
ре при 37
o
С 30 мин.
9)
Высеять 50 мкл клеток на чашку с антибиотиком (добавить 100 мкл
0.1М IPTG и 20 мкл xGal (50 мг/мл)
). Инкубировать 10–12 часов при
37
о
С.
10)
Проанализировать состояние колоний. Белые колонии, как прави-
ло, представлены трансформированными клетками, несущими ре-
комбинантную плазмиду. Голубой цвет колонии указывает на при-
сутствие в них клеток, в которых присутствует вектор без вставки
ДНК.
11)
Рассчитать компетентность клеток: если выросло «N» колоний, то
компетентность = N × 10
6
[колоний/мкг].
Комментарии к методике:
1) При тепловом шоке температура может быть в интервале 40–50
о
С.
2) Если тепловой шок заменить замораживанием в жидком азоте и оттаиванием до
комнатной температуры, то компетентность повысится в ~10 раз. 
      c) Реакцию лигирования проводить при температуре 16 оС в течение
          30–40 мин.
   2) Оттаять во льду 0.5 M β-меркаптоэтанол и аликвоту компетентных
      клеток.
   3) К    аликвоте       компетентных    клеток    добавить:      4   мкл   0.5M
      β-меркаптоэтанола и 2 мкл пДНК;
   4) Инкубировать смесь при 0 oC 20–60 мин.
   5) Быстро, но без встряхивания, перенести клетки на 42 oC. Инкубиро-
      вать 30 с.
   6) Быстро перенести в лед на 2 мин.
   7) После охлаждения к аликвоте клеток добавить 400 мкл буфера
      (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10мМ NaCI, 10мМ KCI).
   8) Выращивать, перемешивая горизонтально на бактериальном шейке-
      ре при 37 oС 30 мин.
   9) Высеять 50 мкл клеток на чашку с антибиотиком (добавить 100 мкл
      0.1М IPTG и 20 мкл xGal (50 мг/мл)). Инкубировать 10–12 часов при
      37 оС.
   10) Проанализировать состояние колоний. Белые колонии, как прави-
      ло, представлены трансформированными клетками, несущими ре-
      комбинантную плазмиду. Голубой цвет колонии указывает на при-
      сутствие в них клеток, в которых присутствует вектор без вставки
      ДНК.
   11) Рассчитать компетентность клеток: если выросло «N» колоний, то
      компетентность = N × 106 [колоний/мкг].


Комментарии к методике:
1) При тепловом шоке температура может быть в интервале 40–50 оС.
2) Если тепловой шок заменить замораживанием в жидком азоте и оттаиванием до
   комнатной температуры, то компетентность повысится в ~10 раз.
                                         58

Страницы