Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 57 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

57
2) PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт к неболь-
шому увеличению компетентности.
3) DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботит-
ся о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа при посто-
янном перемешивании.
4) Замораживание в жидком азоте повышает компетентность в 4–5 раз.
Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового
шока»
1) Приготовить свежий раствор пДНК (плазмидная ДНК) с концентра-
цией 50 нг/мкл.
a)
Необходимо измерить концентрацию вектора и пДНК. Протести-
ровать различные соотношения вектор : пДНК для нахождения
оптимального значения. Для этого, в двух пробирках приготовить
смесь вектор : пДНК в соотношениях 1 : 1 и 1 : 3. Следующее со-
отношение позволяет рассчитать молярное отношение к молеку-
лярной массе для вектора и фрагменту ДНК, который использует-
ся для встраивания в вектор
.
b) Рассчитав подходящее соотношение вектор : вставка, поставить
реакцию лигирования:
вектор – 100 нг,
вставка – 50 нг,
10х буфер (
50мM Трис-HCI (pH 7.8 при 25 °C);
10мM MgCI
2
; 10мM ДTT; 1мM ATФ;
25 мкг/мл БСА
) – 1 мкл,
Т4 ДНК-лигаза – 1 ед.,
деионизованная вода – до 10 мкл.
масса векто
р
а
(
нг
)
⋅
р
азме
р
вставки
(
kb
)
р
азме
р
векто
р
а
(
kb
)
вставк
а
векто
р
масса вставки
(
нг
)
=
2)    PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт к неболь-
      шому увеличению компетентности.
3)    DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботит-
      ся о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа при посто-
      янном перемешивании.
4)    Замораживание в жидком азоте повышает компетентность в 4–5 раз.


Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового
шока»

     1) Приготовить свежий раствор пДНК (плазмидная ДНК) с концентра-
       цией 50 нг/мкл.
       a) Необходимо измерить концентрацию вектора и пДНК. Протести-
           ровать различные соотношения вектор : пДНК для нахождения
           оптимального значения. Для этого, в двух пробирках приготовить
           смесь вектор : пДНК в соотношениях 1 : 1 и 1 : 3. Следующее со-
           отношение позволяет рассчитать молярное отношение к молеку-
           лярной массе для вектора и фрагменту ДНК, который использует-
           ся для встраивания в вектор.

 масса вектора (нг) ⋅ размер вставки (kb)           вставка
            размер вектора (kb)                     вектор      = масса вставки (нг)

       b) Рассчитав подходящее соотношение вектор : вставка, поставить
           реакцию лигирования:
                 вектор                                          – 100 нг,
                 вставка                                         – 50 нг,
                 10х буфер (50мM Трис-HCI (pH 7.8 при 25 °C);
                  10мM MgCI2; 10мM ДTT; 1мM ATФ;
                  25 мкг/мл БСА)                          – 1 мкл,
                 Т4 ДНК-лигаза                            – 1 ед.,
                 деионизованная вода                       – до 10 мкл.


                                         57

Страницы