Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 56 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

56
Работа 18. Приготовление компетентных клеток
1.
Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой без ан-
тибиотика. Выращивать при 37
o
С 10–12 часов.
2.
Несколько колоний (10–12) диаметром ~2–3 мм поместить в колбу с
40 мл жидкой среды (
2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт,
10мМ NaCI, 10 мМ KCI
).
3.
Выращивать бактерии при постоянном помешивании (200–300 rpm)
при 37
o
С до оптической плотности OD
600
= 0.6.
Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде!!!
4.
В 50 мл пробирку поместить 30 мл культуры, охладить на льду в те-
чение 10–15 мин.
5.
Центрифугировать на 2 000 rpm при 4
o
C 10 мин, тщательно удалить
жидкость.
6.
Осадок бактерий суспензировать в 10 мл буфера (10 мМ HEPES рН 6.7,
55мМ MgCI
2
, 15 мМ CaCI, 250мМ KCI). Охладить на льду 10–15 мин.
7.
Центрифугировать на 2 000 rpm при 4
o
C 10 мин, тщательно удалить
жидкость.
8.
Ресуспензировать осадок в 2 мл буфере (см. п. 6), добавить DMSO до
3.5 %. Охладить на льду 10–15 мин.
9.
Разаликвотировать по 100 мкл в охлажденные 2 мл пробирки. Замо-
розить в жидком азоте. Хранить в жидком азоте или на –70
o
С.
Комментарии к методике:
1) Рост при 37
o
С приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компе-
тентности от плотности клеток. При 18
o
С высокая компетентность достигается в
широком интервале. 
Работа 18. Приготовление компетентных клеток


     1. Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой без ан-
       тибиотика. Выращивать при 37 oС 10–12 часов.
     2. Несколько колоний (10–12) диаметром ~2–3 мм поместить в колбу с
       40 мл жидкой среды (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт,
       10мМ NaCI, 10 мМ KCI).
     3. Выращивать бактерии при постоянном помешивании (200–300 rpm)
       при 37 oС до оптической плотности OD600 = 0.6.
       Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде!!!
     4. В 50 мл пробирку поместить 30 мл культуры, охладить на льду в те-
       чение 10–15 мин.
     5. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить
       жидкость.
     6. Осадок бактерий суспензировать в 10 мл буфера (10 мМ HEPES рН 6.7,
       55мМ MgCI2, 15 мМ CaCI, 250мМ KCI). Охладить на льду 10–15 мин.
     7. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить
       жидкость.
     8. Ресуспензировать осадок в 2 мл буфере (см. п. 6), добавить DMSO до
       3.5 %. Охладить на льду 10–15 мин.
     9. Разаликвотировать по 100 мкл в охлажденные 2 мл пробирки. Замо-
       розить в жидком азоте. Хранить в жидком азоте или на –70 oС.


Комментарии к методике:
1)    Рост при 37 oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компе-
      тентности от плотности клеток. При 18 oС высокая компетентность достигается в
      широком интервале.



                                        56

Страницы