Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 60 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

60
Комментарии к методике:
1) При щелочной денатурации ДНК нужно постараться как можно меньше раз-
дробить геномную ДНК, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в даль-
нейшем.
2) Превышение времени денатурации приводит к тому, что плазмида денатури-
рует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко,
что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурирован-
ные плазмиды можно использовать для сиквенса, они не режутся рестрикта-
зами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.
Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-
хлороформной экстракции (экспресс-метод)
1.
Перенести колонию клеток в пробирку. Добавить 25 мкл STE буфе-
ра (
10мМ Трис-HCI рН 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ ЭДТА).
2.
Перемешать на вортексе и добавить 25 мкл смеси фенол : хлоро-
форм : изопропанол в соотношении 25 : 24 : 1.
3.
Перемешать полученную смесь на вортексе 1 минуту. Центрифуги-
ровать при 12 000 rpm 20 с.
4.
Супернатант перенести в новую пробирку. Центрифугировать при
12 000 rpm 10 мин.
5.
Супернатант можно использовать для ПЦР-анализа.
Комментарии к методике:
1) Для более качественной очистки пДНК можно использовать осаждение 96 %
спиртом после п. 5. 
Комментарии к методике:
1) При щелочной денатурации ДНК нужно постараться как можно меньше раз-
  дробить геномную ДНК, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в даль-
  нейшем.
2) Превышение времени денатурации приводит к тому, что плазмида денатури-
  рует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко,
  что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурирован-
  ные плазмиды можно использовать для сиквенса, они не режутся рестрикта-
  зами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.


Работа      21.   Выделение   плазмидной      ДНК    методом      фенол-
хлороформной экстракции (экспресс-метод)


1. Перенести колонию клеток в пробирку. Добавить 25 мкл STE буфе-
  ра (10мМ Трис-HCI рН 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ ЭДТА ).
2. Перемешать на вортексе и добавить 25 мкл смеси фенол : хлоро-
  форм : изопропанол в соотношении 25 : 24 : 1.
3. Перемешать полученную смесь на вортексе 1 минуту. Центрифуги-
  ровать при 12 000 rpm 20 с.
4. Супернатант перенести в новую пробирку. Центрифугировать при
  12 000 rpm 10 мин.
5. Супернатант можно использовать для ПЦР-анализа.


Комментарии к методике:
1) Для более качественной очистки пДНК можно использовать осаждение 96 %
  спиртом после п. 5.




                                   60

Страницы