Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 30 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

30
действие амилазы, окраска остается синей. Если описанной картины не на-
блюдается, то опыт повторяют через 10 мин. Результаты вносят в таблицу.
• Записывают в тетрадь полученные результаты. Делают выводы о харак-
тере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы.
2. Выявление ингибирующего действия малоновой кислоты на актив-
ность сукцинатдегидрогеназы (в присутствии соединений, структурно сход-
ных с янтарной кислотой (малоновая, щавелевая, глутаровая, фенилпропио-
новая), но неспособных дегидрироваться, может происходить блокирование
активного центра сукцинатдегидрогеназы и тем самым тормозить протекание
нормальной реакции). В 3 пробирки внести по 3–4 г тщательно измельчен-
ной ткани поперечно-полосатой мышцы. В первую прибавить 0,4 мл дистил-
лированной воды, во
вторую – 0,2 мл 1%-го раствора малоновой кислоты и
0,2 мл воды, а в третью – 0,4 мл 1%-го раствора малоновой кислоты. Во все
пробирки долить по 1 мл 1%-го раствора янтарной кислоты, и по 2–3 капли
1%-го раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешать,
добавить по 3–4 капли вазелинового масла и выдерживать в термостате при
38
о
С. Через 5–10 мин в первой пробирке произойдет почти полное исчезно-
вение голубой окраски, некоторое уменьшение интенсивности окраски во
второй пробирке и полное сохранение ее в третьей.
3. Определение типа ингибирования и значения K
i
МДГ ионами цинка
(по Диксону)
. Для этого следует измерить скорость ферментативной реакции
при добавлении в среду спетрофотометрирования ионов Mn
2+
в концентраци-
ях 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 мМ (при внесении 0.01 мл 100 мМ
MnCl
2 в 2 мл кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометриро-
вания будет соответствовать 0.5 мМ). Измерение следует провести с различ-
ными концентрациями оксалоацетата – 0.05 мМ и 0.15 мМ. Концентрация
НАДН и объем внесения фермента остаются неизменными. Далее построить
график зависимость 1/Vo от [Mn
2+
] при различных концентрациях оксалоаце-
тата, и определить с его помощью тип ингибирования и K
i
. 
   действие амилазы, окраска остается синей. Если описанной картины не на-
   блюдается, то опыт повторяют через 10 мин. Результаты вносят в таблицу.
• Записывают в тетрадь полученные результаты. Делают выводы о харак-
   тере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы.
     2. Выявление ингибирующего действия малоновой кислоты на актив-
ность сукцинатдегидрогеназы (в присутствии соединений, структурно сход-
ных с янтарной кислотой (малоновая, щавелевая, глутаровая, фенилпропио-
новая), но неспособных дегидрироваться, может происходить блокирование
активного центра сукцинатдегидрогеназы и тем самым тормозить протекание
нормальной реакции). В 3 пробирки внести по 3–4 г тщательно измельчен-
ной ткани поперечно-полосатой мышцы. В первую прибавить 0,4 мл дистил-
лированной воды, во вторую – 0,2 мл 1%-го раствора малоновой кислоты и
0,2 мл воды, а в третью – 0,4 мл 1%-го раствора малоновой кислоты. Во все
пробирки долить по 1 мл 1%-го раствора янтарной кислоты, и по 2–3 капли
1%-го раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешать,
добавить по 3–4 капли вазелинового масла и выдерживать в термостате при
38 оС. Через 5–10 мин в первой пробирке произойдет почти полное исчезно-
вение голубой окраски, некоторое уменьшение интенсивности окраски во
второй пробирке и полное сохранение ее в третьей.
     3. Определение типа ингибирования и значения Ki МДГ ионами цинка
(по Диксону). Для этого следует измерить скорость ферментативной реакции
при добавлении в среду спетрофотометрирования ионов Mn2+ в концентраци-
ях 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 мМ (при внесении 0.01 мл 100 мМ
MnCl2 в 2 мл кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометриро-
вания будет соответствовать 0.5 мМ). Измерение следует провести с различ-
ными концентрациями оксалоацетата – 0.05 мМ и 0.15 мМ. Концентрация
НАДН и объем внесения фермента остаются неизменными. Далее построить
график зависимость 1/Vo от [Mn2+] при различных концентрациях оксалоаце-
тата, и определить с его помощью тип ингибирования и Ki.




                                        30

Страницы