Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 29 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

29
субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание с актив-
ным центром фермента. Неконкурентное ингибирование наблюдается, ко-
гда ингибитор и фермент не сходны по структуре и ингибитор присоеди-
няется к регуляторному центру фермента. При бесконкурентном ингиби-
ровании ингибитор присоединяется к комплексу фермент–субстрат.
Принцип действия ингибитора, тип его ингибирования определяют путем
сравнения кинетики реакции в присутствии ингибитора и без него. Для опре-
деления констант ингибирования используются различные координаты – Лай-
нуивера – Берка, Иди – Хоффсти, Уэбба и пр. Для определения типа ингиби-
рования и величины К
i
широко используется метод Диксона. Если построить
зависимость 1/Vo от [I] при различных [S], то абсцисса общей точки пересече-
ния этих прямых линий дает константу ингибирования, т. е. этот метод требует
измерения изменения скорости реакции при нескольких заданных постоянных
концентрациях субстрата при изменении концентрации ингибитора.
Оборудование и реактивы.
1) 1%-й раствор NaCl, CuSO4, раствор слюны, йод.
2) 1%-й раствор малоновой кислоты, 1%-й раствор метиленового си-
него, ткань поперечно-полосатой мышцы.
3) спектрофотометр, среда спектрофотометрирования МДГ (50 мМ
трис-НCl буфер, рН 7.5, 0.15 мМ НАДН, две различные концентрации ок-
салоацетата: 0.05 мМ и 0.15 мМ), 100 мМ MnCl
2 (М.в. 198 г/л), гомогенный
ферментный препарат.
Ход работы.
1.
Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы слюны
• В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, во вторую –
8 капель воды и 2 капли 1%-го раствора хлорида натрия, в третью –
8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди (II).
• В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной (1 : 10) слю-
ны, содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель рас-
твора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.
• В это время готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой), подкрашенной
каплей раствора йода, и добавляют в них по 2–3 капли содержимого опыт-
ных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления
крахмала амилазой. В первой пробирке появляется фиолетовая или красно-
бурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют
роль активатора,
появляется желтая окраска, а в третьей пробирке, где ионы меди тормозят 
субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание с актив-
ным центром фермента. Неконкурентное ингибирование наблюдается, ко-
гда ингибитор и фермент не сходны по структуре и ингибитор присоеди-
няется к регуляторному центру фермента. При бесконкурентном ингиби-
ровании ингибитор присоединяется к комплексу фермент–субстрат.
     Принцип действия ингибитора, тип его ингибирования определяют путем
сравнения кинетики реакции в присутствии ингибитора и без него. Для опре-
деления констант ингибирования используются различные координаты – Лай-
нуивера – Берка, Иди – Хоффсти, Уэбба и пр. Для определения типа ингиби-
рования и величины Кi широко используется метод Диксона. Если построить
зависимость 1/Vo от [I] при различных [S], то абсцисса общей точки пересече-
ния этих прямых линий дает константу ингибирования, т. е. этот метод требует
измерения изменения скорости реакции при нескольких заданных постоянных
концентрациях субстрата при изменении концентрации ингибитора.
     Оборудование и реактивы.
     1) 1%-й раствор NaCl, CuSO4, раствор слюны, йод.
     2) 1%-й раствор малоновой кислоты, 1%-й раствор метиленового си-
него, ткань поперечно-полосатой мышцы.
     3) спектрофотометр, среда спектрофотометрирования МДГ (50 мМ
трис-НCl буфер, рН 7.5, 0.15 мМ НАДН, две различные концентрации ок-
салоацетата: 0.05 мМ и 0.15 мМ), 100 мМ MnCl2 (М.в. 198 г/л), гомогенный
ферментный препарат.
     Ход работы.
     1. Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы слюны
• В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, во вторую –
   8 капель воды и 2 капли 1%-го раствора хлорида натрия, в третью –
   8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди (II).
• В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной (1 : 10) слю-
   ны, содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель рас-
   твора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.
• В это время готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой), подкрашенной
   каплей раствора йода, и добавляют в них по 2–3 капли содержимого опыт-
   ных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления
   крахмала амилазой. В первой пробирке появляется фиолетовая или красно-
   бурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора,
   появляется желтая окраска, а в третьей пробирке, где ионы меди тормозят
                                    29

Страницы