Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 28 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

28
Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН
Разные ферменты максимально активны при разных значениях рН;
при рН выше и ниже оптимальной их активность снижается. Оптимум рН
обычно находится в пределах, близких к нейтральной среде. Для некото-
рых энзимов – в кислой или щелочной области. Эффект рН складывается
из влияния на стабильность фермента и на величину ионизации функцио-
нальных групп
его белковой части, субстратов и кофакторов.
Для экспериментального определения оптимума рН измеряют ско-
рость ферментативной реакции, используя буферные растворы с различ-
ными значениями водородного показателя. На кривую зависимости актив-
ности фермента от рН существенное влияние могут оказывать такие фак-
торы, как состав буфера и величина ионной силы.
Оборудование и реактивы.
0.1 М фосфатный буфер с значениями рН 5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0,
раствор слюны, 0.1%-й раствор йода в 0.2%-м растворе йодида калия, 1%-й
раствор крахмала.
Ход работы.
Определение влияния рН на активность амилазы слюны по изменению
интенсивности окрашивания раствора крахмала с йодом. Для этого в семь
пробирок налить по 2 мл фосфатного буферного раствора с различными
значениями рН (5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0). Затем прилить по 5 мл 1%-го
раствора крахмала и по 1 мл слюны. Содержимое пробирок перемешать и
поместить в термостат на 10 мин при 38
о
С. После инкубации в термостате
во все пробирки прибавляют по 5 капель йода, перемешивают, наблюдают
окраску и отмечают активность. Для амилазы слюны оптимум рН 6.8, а в
кислой и щелочной среде активность фермента снижается.
Работа 4. Исследование влияния ингибиторов
Ингибиторы, специфически взаимодействующие с ферментами, де-
лятся на две группы – необратимые и обратимые. Действие необратимых
ингибиторов можно наблюдать, блокируя функционально важные группы
ферментов (например, модифицируя SH-группы йодацетатом). Большин-
ство ингибиторов ферментов действуют обратимо, т. е. не вносят в моле-
кулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации. Обрати-
мое ингибирование может
быть конкурентное, неконкурентное и бескон-
курентное. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и 
        Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН

    Разные ферменты максимально активны при разных значениях рН;
при рН выше и ниже оптимальной их активность снижается. Оптимум рН
обычно находится в пределах, близких к нейтральной среде. Для некото-
рых энзимов – в кислой или щелочной области. Эффект рН складывается
из влияния на стабильность фермента и на величину ионизации функцио-
нальных групп его белковой части, субстратов и кофакторов.
    Для экспериментального определения оптимума рН измеряют ско-
рость ферментативной реакции, используя буферные растворы с различ-
ными значениями водородного показателя. На кривую зависимости актив-
ности фермента от рН существенное влияние могут оказывать такие фак-
торы, как состав буфера и величина ионной силы.
    Оборудование и реактивы.
    0.1 М фосфатный буфер с значениями рН 5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0,
раствор слюны, 0.1%-й раствор йода в 0.2%-м растворе йодида калия, 1%-й
раствор крахмала.
    Ход работы.
    Определение влияния рН на активность амилазы слюны по изменению
интенсивности окрашивания раствора крахмала с йодом. Для этого в семь
пробирок налить по 2 мл фосфатного буферного раствора с различными
значениями рН (5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0). Затем прилить по 5 мл 1%-го
раствора крахмала и по 1 мл слюны. Содержимое пробирок перемешать и
поместить в термостат на 10 мин при 38 оС. После инкубации в термостате
во все пробирки прибавляют по 5 капель йода, перемешивают, наблюдают
окраску и отмечают активность. Для амилазы слюны оптимум рН 6.8, а в
кислой и щелочной среде активность фермента снижается.
                Работа 4. Исследование влияния ингибиторов
    Ингибиторы, специфически взаимодействующие с ферментами, де-
лятся на две группы – необратимые и обратимые. Действие необратимых
ингибиторов можно наблюдать, блокируя функционально важные группы
ферментов (например, модифицируя SH-группы йодацетатом). Большин-
ство ингибиторов ферментов действуют обратимо, т. е. не вносят в моле-
кулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации. Обрати-
мое ингибирование может быть конкурентное, неконкурентное и бескон-
курентное. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и
                                     28

Страницы