Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 26 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

26
4. Обеспечить условия измерения начальной скорости реакции, по-
скольку скорость ферментативной реакции со временем снижается. Это
можно объяснить снижением степени насыщения фермента субстратом,
который расходуется в процессе ферментативной реакции; увеличением
скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингиби-
рованием фермента образующимися продуктами реакции; изменением ус-
ловий, например, снижением рН в ходе реакции
; инактивацией фермента и др.
Оборудование и реактивы.
Спектрофотометр, кюветы, пипетки, гомогенный ферментный препарат МДГ.
Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 9.0,
1 мМ НАД
+
. Отдельно готовится 50 мМ малат (М.в. 134.1 г/л).
Ход работы.
Для определения константы Михаэлиса МДГ по малату в 2 мл среды
спектрофотометриярования внести 0.01 мл раствора МДГ и начать реак-
цию добавлением различных концентраций малата – от 0.25 мМ до 2.5 мМ
(при внесении 0.01 мл 50 мМ малата в кювету концентрация субстрата в
среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.25 мМ). Изме-
рить скорость ферментативной реакции при 10 различных значениях кон-
центрации малата (0.25 мМ, 0.5 мМ, 0.75 мМ, 1.0 мМ, 1.25
мМ, 1.5 мМ,
1.75 мМ, 2.0 мМ, 2.25 мМ, 2.5 мМ). Далее построить график в двойных об-
ратных координата (по Лайнуиверу – Берку), и определить с его помощью
К
м МДГ по малату. 
     4. Обеспечить условия измерения начальной скорости реакции, по-
скольку скорость ферментативной реакции со временем снижается. Это
можно объяснить снижением степени насыщения фермента субстратом,
который расходуется в процессе ферментативной реакции; увеличением
скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингиби-
рованием фермента образующимися продуктами реакции; изменением ус-
ловий, например, снижением рН в ходе реакции; инактивацией фермента и др.
     Оборудование и реактивы.
     Спектрофотометр, кюветы, пипетки, гомогенный ферментный препарат МДГ.
     Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 9.0,
1 мМ НАД+. Отдельно готовится 50 мМ малат (М.в. 134.1 г/л).
     Ход работы.
     Для определения константы Михаэлиса МДГ по малату в 2 мл среды
спектрофотометриярования внести 0.01 мл раствора МДГ и начать реак-
цию добавлением различных концентраций малата – от 0.25 мМ до 2.5 мМ
(при внесении 0.01 мл 50 мМ малата в кювету концентрация субстрата в
среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.25 мМ). Изме-
рить скорость ферментативной реакции при 10 различных значениях кон-
центрации малата (0.25 мМ, 0.5 мМ, 0.75 мМ, 1.0 мМ, 1.25 мМ, 1.5 мМ,
1.75 мМ, 2.0 мМ, 2.25 мМ, 2.5 мМ). Далее построить график в двойных об-
ратных координата (по Лайнуиверу – Берку), и определить с его помощью
Км МДГ по малату.




                                   26

Страницы