Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 24 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

24
Ход работы.
1. Специфическое проявление дегидрогеназ. Дегидрогеназы после их
электрофоретического разделения в ПААГ обычно прокрашивают с помо-
щью нитросинего тетразолия. Этот метод успешно используется для выяв-
ления многих и неокислительных ферментов, каталитическая активность
которых может быть определена с использованием дегидрогеназ в качестве
вспомогательных ферментов. Сущность метода заключается в следующем.
Под действием дегидрогеназы в присутствии соответствующего субстрата
происходит восстановление НАД
+
(или НАДФ
+
). При участии феназинме-
тасульфата (который выполняет роль вспомогательного переносчика) во-
дород затем переносится на нитросиний тетразолий. Этот краситель в
окисленном состоянии имеет желтую окраску и хорошо растворим в воде.
Его восстановленная форма (диформазан) практически нерастворима в во-
де и окрашена в фиолетовый цвет. Восстановленная форма красителя сор-
бируется на той
белковой фракции в геле, под действием которой произошло
восстановление НАД
+
(НАДФ
+
). Таким образом, появление окрашенной по-
лосы будет свидетельствовать о наличии в геле исследуемого фермента; вме-
сте с тем идентифицируется его местоположение.
Для прокрашивания белковых полос на малатдегидрогеназную актив-
ность гель после окончания электрофореза сразу вынимают из пластинки,
споласкивают в воде или буферном растворе и помещают в реакционную
смесь 1. Гель инкубируют
в темноте при 37
о
С в течение 15–120 мин. По-
сле прокрашивания гель промывают дистиллированной водой и хранят в
7%-й уксусной кислоте. Окраска стабильна в течение недели.
2. Выявление протеаз.
Если после диск-электрофореза препарата про-
теазы гель выдержать в растворе денатурированного цитохрома
с, то за
счет протеолитического действия на общем коричневом фоне геля про-
явится светлая полоса, которая соответствует положению протеазы в геле.
Сразу после окончания электрофореза гель споласкивают дистиллирован-
ной водой или буферным раствором, помещают в реакционную смесь 2 и
инкубируют при 37
о
С в течение 1 ч. Затем гель переносят в реакционную
смесь 3, и выдерживают еще час при той же температуре, после чего по-
мещают в 12.5%-й раствор ТХУ. 
    Ход работы.
    1. Специфическое проявление дегидрогеназ. Дегидрогеназы после их
электрофоретического разделения в ПААГ обычно прокрашивают с помо-
щью нитросинего тетразолия. Этот метод успешно используется для выяв-
ления многих и неокислительных ферментов, каталитическая активность
которых может быть определена с использованием дегидрогеназ в качестве
вспомогательных ферментов. Сущность метода заключается в следующем.
Под действием дегидрогеназы в присутствии соответствующего субстрата
происходит восстановление НАД+ (или НАДФ+). При участии феназинме-
тасульфата (который выполняет роль вспомогательного переносчика) во-
дород затем переносится на нитросиний тетразолий. Этот краситель в
окисленном состоянии имеет желтую окраску и хорошо растворим в воде.
Его восстановленная форма (диформазан) практически нерастворима в во-
де и окрашена в фиолетовый цвет. Восстановленная форма красителя сор-
бируется на той белковой фракции в геле, под действием которой произошло
восстановление НАД+ (НАДФ+). Таким образом, появление окрашенной по-
лосы будет свидетельствовать о наличии в геле исследуемого фермента; вме-
сте с тем идентифицируется его местоположение.
    Для прокрашивания белковых полос на малатдегидрогеназную актив-
ность гель после окончания электрофореза сразу вынимают из пластинки,
споласкивают в воде или буферном растворе и помещают в реакционную
смесь 1. Гель инкубируют в темноте при 37 оС в течение 15–120 мин. По-
сле прокрашивания гель промывают дистиллированной водой и хранят в
7%-й уксусной кислоте. Окраска стабильна в течение недели.
    2. Выявление протеаз. Если после диск-электрофореза препарата про-
теазы гель выдержать в растворе денатурированного цитохрома с, то за
счет протеолитического действия на общем коричневом фоне геля про-
явится светлая полоса, которая соответствует положению протеазы в геле.
Сразу после окончания электрофореза гель споласкивают дистиллирован-
ной водой или буферным раствором, помещают в реакционную смесь 2 и
инкубируют при 37 оС в течение 1 ч. Затем гель переносят в реакционную
смесь 3, и выдерживают еще час при той же температуре, после чего по-
мещают в 12.5%-й раствор ТХУ.




                                   24

Страницы