Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 23 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

23
2. Проявление протеинов с помощью амидо-черного 10В.
Поместить гелевую пластинку в реакционную смесь 2 на несколько
суток, после чего промыть окрашенный гель несколько раз водой. В све-
жеприготовленном красителе белковые полосы окрашиваются в темно-
синий цвет, в постоявшем – почти в черный.
3. Окрашивание белков нитратом серебра.
1.
Фиксация: поместить гелевую пластину в реакционную смесь 3 на
20 минут.
2.
Отмыть гель водой в течение 5–10 минут.
3.
Предобработка геля 50%-м ацетоном в течение 5–10 мин.
4.
Залить гелевую пластинку реакционной смесью 4 на 1 минуту, по-
сле чего отмыть гель несколько раз водой.
5.
Окраска серебром: поместить гель на 8 мин в реакционную смесь 5,
после чего отмыть его несколько раз водой.
6.
Проявление: опустить гель в реакционную смесь 6 до появления
белковых полос.
7.
Для хранения залить гелевую пластинку 7%-й уксусной кислотой.
Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ
Ферментативную активность белковых компонентов исследуемой
смеси после электрофоретического разделения можно выявить либо после
элюции их из геля, либо непосредственно в геле.
В первом случае гель разрезают на отдельные диски, гомогенизируют в
соответствующем буфере, центрифугируют или фильтруют и в надосадоч-
ной жидкости измеряют ферментативную активность. Во втором случае
белковые полосы специфически прокрашивают
непосредственно в геле.
Оборудование и реактивы.
Реакционная смесь 1: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 8.3, 20 мМ малат, 3мМ
НАД
+
, нитросиний тетразолий (предварительно растворенный в 0.5 мл эти-
ленгликоля) и феназинметасульфат в расчете 4 мг на 10 мл раствора.
Реакционная смесь 2 (указаны конечные концентрации): 2-амино-2-
метил-1,3-пропандиольный буфер – 25 мМ, рН 8.5, цитохром
с – 2 %,
мочевина – 2 М, хлористый кальций – 1.2 мМ.
Реакционная смесь 3: 25 мМ 2-амино-2-метил-1,3-пропандиольный
буфер, рН 8.5, содержащий 1.2 мМ хлористый кальций. 
    2. Проявление протеинов с помощью амидо-черного 10В.
    Поместить гелевую пластинку в реакционную смесь 2 на несколько
суток, после чего промыть окрашенный гель несколько раз водой. В све-
жеприготовленном красителе белковые полосы окрашиваются в темно-
синий цвет, в постоявшем – почти в черный.
    3. Окрашивание белков нитратом серебра.
    1. Фиксация: поместить гелевую пластину в реакционную смесь 3 на
       20 минут.
    2. Отмыть гель водой в течение 5–10 минут.
    3. Предобработка геля 50%-м ацетоном в течение 5–10 мин.
    4. Залить гелевую пластинку реакционной смесью 4 на 1 минуту, по-
       сле чего отмыть гель несколько раз водой.
    5. Окраска серебром: поместить гель на 8 мин в реакционную смесь 5,
       после чего отмыть его несколько раз водой.
    6. Проявление: опустить гель в реакционную смесь 6 до появления
       белковых полос.
    7. Для хранения залить гелевую пластинку 7%-й уксусной кислотой.

          Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ

    Ферментативную активность белковых компонентов исследуемой
смеси после электрофоретического разделения можно выявить либо после
элюции их из геля, либо непосредственно в геле.
    В первом случае гель разрезают на отдельные диски, гомогенизируют в
соответствующем буфере, центрифугируют или фильтруют и в надосадоч-
ной жидкости измеряют ферментативную активность. Во втором случае
белковые полосы специфически прокрашивают непосредственно в геле.
    Оборудование и реактивы.
    Реакционная смесь 1: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 8.3, 20 мМ малат, 3мМ
НАД+, нитросиний тетразолий (предварительно растворенный в 0.5 мл эти-
ленгликоля) и феназинметасульфат в расчете 4 мг на 10 мл раствора.
    Реакционная смесь 2 (указаны конечные концентрации): 2-амино-2-
метил-1,3-пропандиольный буфер – 25 мМ, рН 8.5, цитохром с – 2 %,
мочевина – 2 М, хлористый кальций – 1.2 мМ.
    Реакционная смесь 3: 25 мМ 2-амино-2-метил-1,3-пропандиольный
буфер, рН 8.5, содержащий 1.2 мМ хлористый кальций.
                                  23

Страницы