Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 21 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

21
вают нагретые до комнатной температуры растворы). Концентрирующий
гель (5 % акриламида, 0.125М трис-буфера, 0.1 % ДДС): 2 части раствора
(1), 3 части раствора (2), 3 части раствора (4), 4 части воды, 0.0072 части
N,N,N',N-тетраметилэтилен диамина (ТЕМЕД). Полимеризуется за 30–40 мин
при комнатной температуре.
Ход работы.
Пробу смешивают с буфером для проб в соотношении 1 : 1 и нагрева-
ют на водяной бане при 80
о
С в течение 5 мин. На 1 см
2
поверхности геля
наносят 0.1–2 мг белка в растворе. До тех пор пока белки не войдут в гель,
электрофорез ведут при 50 В. Напряжение 100 В поддерживают, пока бел-
ки не достигнут разделяющего геля. Разделение ведут при 200 В в течение
2 ч и заканчивают, когда полоса лидирующего красителя приблизится к
концу геля.
Для построения калибровочной
кривой и определения молекулярной
массы субъединиц используются стандартные маркерные белки (кДа): цел-
люлаза – 94,6; бычий сывороточный альбумин – 66,2; яичный альбумин – 45;
карбоангидраза – 31; лизоцим – 14,4; цитохром
с – 12,5. После проведения
электрофореза гели окрасить по методике с нитратом серебра. Гели хранить
в 7%-й уксусной кислоте.
Для расчета молекулярной массы субъединиц
фермента с помощью ДДС-ПААГ электрофореза необходимо построить ка-
либровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой
.
Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ
Как только прекращается действие электрического поля, разделив-
шиеся белковые зоны склонны «расплываться» в силу тепловой диффузии.
Поэтому сразу после окончания разделения белки необходимо фиксиро-
вать в тех местах геля, куда они успели дойти. Проще всего это сделать
осаждением из раствора прямо в геле. Для фиксации осаждением пригод-
ны крепкие растворы
уксусной кислоты или трихлоруксусной кислоты.
Часто фиксацию белков совмещают с их окрашиванием. Наиболее часто
для прокрашивания белка после электрофореза в ПААГ используется ами-
до-черный 10В и кумасси бриллиантовый синий R-250. Второй из них бо-
лее чувствительный, равномернее связывается с различными белками, сла-
бо сорбируется ПААГ и поэтому легко от него отмывается
. Однако после 
вают нагретые до комнатной температуры растворы). Концентрирующий
гель (5 % акриламида, 0.125М трис-буфера, 0.1 % ДДС): 2 части раствора
(1), 3 части раствора (2), 3 части раствора (4), 4 части воды, 0.0072 части
N,N,N',N-тетраметилэтилен диамина (ТЕМЕД). Полимеризуется за 30–40 мин
при комнатной температуре.
     Ход работы.
     Пробу смешивают с буфером для проб в соотношении 1 : 1 и нагрева-
ют на водяной бане при 80 оС в течение 5 мин. На 1 см2 поверхности геля
наносят 0.1–2 мг белка в растворе. До тех пор пока белки не войдут в гель,
электрофорез ведут при 50 В. Напряжение 100 В поддерживают, пока бел-
ки не достигнут разделяющего геля. Разделение ведут при 200 В в течение
2 ч и заканчивают, когда полоса лидирующего красителя приблизится к
концу геля.
     Для построения калибровочной кривой и определения молекулярной
массы субъединиц используются стандартные маркерные белки (кДа): цел-
люлаза – 94,6; бычий сывороточный альбумин – 66,2; яичный альбумин – 45;
карбоангидраза – 31; лизоцим – 14,4; цитохром с – 12,5. После проведения
электрофореза гели окрасить по методике с нитратом серебра. Гели хранить
в 7%-й уксусной кислоте. Для расчета молекулярной массы субъединиц
фермента с помощью ДДС-ПААГ электрофореза необходимо построить ка-
либровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой.

          Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ

    Как только прекращается действие электрического поля, разделив-
шиеся белковые зоны склонны «расплываться» в силу тепловой диффузии.
Поэтому сразу после окончания разделения белки необходимо фиксиро-
вать в тех местах геля, куда они успели дойти. Проще всего это сделать
осаждением из раствора прямо в геле. Для фиксации осаждением пригод-
ны крепкие растворы уксусной кислоты или трихлоруксусной кислоты.
Часто фиксацию белков совмещают с их окрашиванием. Наиболее часто
для прокрашивания белка после электрофореза в ПААГ используется ами-
до-черный 10В и кумасси бриллиантовый синий R-250. Второй из них бо-
лее чувствительный, равномернее связывается с различными белками, сла-
бо сорбируется ПААГ и поэтому легко от него отмывается. Однако после


                                    21

Страницы