Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 19 стр.

     Для характеристики электрофоретической подвижности белков в дан-
ных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния,
пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному
расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в
хроматографии, обозначают Rf.
     Оборудование и реактивы.
     Прибор для проведения электрофореза, центрифуга.
     Растворы для гелей: 1) 1 н. HCl – 48 мл, трис – 36.6 г, тетраметилэти-
лендиамин (ТЕМЕД) – 0.23 мл в 100 мл водного раствора, рН 8.9; 2) 30 г
акриламида, 0.8 г метиленбисакриламида в 100 мл водного раствора;
3) 1.4 мг/мл персульфата аммония; 4) 6.4 мл 1М H3PO4, 1.43 г трис, 0.02 мл
ТЕМЕД в 25 мл раствора, рН 6.9; 5) 2.5 г акриламида, 0.63 г метиленбисак-
риламида в 25 мл водного раствора; 6) 40 мг/л рибофлавина. Все растворы,
кроме (3), можно хранить в холодильнике несколько месяцев, раствор (3) –
не более недели. Для приготовления смесей используются нагретые до
комнатной температуры растворы.
     Разделяющий гель (7.5 %): сливают вместе 1 часть раствора (1), 2 части
раствора (2), 1 часть Н2О, 4 части раствора (3). Гель образуется в течение
30 мин. Концентрирующий гель: сливают вместе 1 часть раствора (4), 2 части
раствора (5), 1 часть растовра (6), 4 части Н2О. Гель (2.5 %) формируется за
15–30 мин в зависимости от интенсивности синих лучей солнца, или люми-
несцентной лампы.
     Электродный буфер: 1 г трис, 5 г глицина в 1 л водного раствора (рН 8.3).
     0.001%-й раствор бромфенолового синего, 40%-я сахароза.
     Ход работы.
     Белки из растительной ткани экстрагируют подходящим буфером. Его
состав мало влияет на результаты разделения белков, определяемые соста-
вом буферов в ПААГ и электродных сосудах. Для более четкого разделе-
ния белков экстракт очищают от низкомолекулярных примесей пропуска-
нием через колонку с сефадексом G-25. Эта процедура необходима, если
исходный экстракт имеет высокую ионную силу. Затем белковый экстракт
уплотняют глицерином или сахарозой, доводя их концентрацию в растворе
до 10–20 %, и добавляют 1 каплю раствора бромфенолового синего на 1–2 мл
экстракта. На 1 см2 поверхности геля наносят 0.1–2 мг белка в растворе.
В течение 15–40 мин проводят концентрирование белков при 100–200 В,
3–6 мА/см2. За это время белки проходят концентрирующий гель и соби-
                                     19